研究目的探讨慢性乙型肝炎肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量与肝组织病理学状态和肝组织HBsAg、HBcAg表达强度之间的相关性。研究方法1研究对象1.1入选标准：参照2010年中华医学会肝病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准,选取经过肝穿刺活检的慢性乙型肝炎患者162例,性别与年龄不限。1.2排除标准：(1)合并酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、丙型肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝病、胆汁淤积性肝病、淤血性肝病、肝豆状核变性、血色病及其他非乙肝病毒感染导致的肝病；(2)近半年内曾经使用激素替代药物、或激素拮抗药物、或抗肝纤维化药物的患者；(3)肝硬化失代偿期患者；(4)性腺疾病、内分泌与其他可能影响体内睾酮、雌二醇疾病的患者。2标本采集与保存2.1肝穿组织标本采集与保存：肝组织活检采用1秒钟经皮肝穿刺法。肝组织标本采集后分成两段,长度分别≥1.0cm和≥0.2cm,分别置入空塑料标本管和预存RNA later的塑料标本管内,立即冰冻送检和放入-80℃冻存。2.2外周血单个核细胞分离与保存：Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,离心后细胞沉淀加入少量的PBS,使细胞悬浮,再加入300μL的RNA later,-80℃冰箱冻存。3实验方法3.1肝组织病理状态诊断：肝组织石蜡切片Masson染色和苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色,参照2000年西安全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的标准进行病理学分级(grading, G)和分期(staging, S)。3.2肝组织HBsAg和HBcAg测定：肝组织石蜡切片HBsAg和HBcAg表达强度采用免疫组织化学法(immunohisto-chemistry,IHC)(二步法)测定。3.3肝组织胶原纤维面积比测定：肝组织石蜡切片Masson染色,采用美国PE公司(PerkinElmer)的智能切片分析系统测定肝组织胶原纤维的面积比。3.4肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量测定：采用反转录实时PCR测定。4统计学分析统计分析采用SPSS13.0软件。肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量与肝组织病理学状态和肝组织HBsAg、HBcAg表达强度之间的相关性采用Spearman等级相关分析,与肝组织胶原纤维面积比之间的相关性采用Pearson线性相关分析。肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量在肝组织不同病理学分级、分期之间的差异采用单因素方差分析。性别、年龄、肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量预测肝组织不同病理学分级、分期的效能评价分别采用Byes逐步判别分析。肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量预测肝组织胶原纤维面积比的评价采用曲线估计。结果1肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量与患者性别、年龄、肝组织病理分级和分期、肝组织胶原纤维面积比之间的相关性肝组织内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量与患者性别呈显著负相关(rs=-0.250,P=0.001、rs=-0.206, P=0.008;注：男性赋值为1,女性赋值为0)；与患者年龄呈显著负相关(r=-0.298, P=0.000、r=-0.240, P=0.002);与肝组织病理学分级、分期之间呈显著负相关(雌激素受体amRNA:rs=-0.484, P=0.000、rs=0.477,P=0.000；雄激素受体mRNA:rs=-0.591, P=0.000、rs=-0.523, P=0.000);与肝组织胶原纤维面积比呈显著负相关(r=0.421, P=0.000、r=-0.299, P=0.002);与肝组织HBsAg表达强度无显著相关性(rs=0.053, P=0.502、rs=0.081, P=0.053),与肝组织HBcAg表达强度分别无显著相关性和和呈显著正相关(rs=0.101,P=0.202、rs=0.170,P=0.031)。外周血单个核细胞内雌激素受体a、雄激素受体mRNA含量与患者性别无显著相关性(rs=0.014,P=0.894、rs=-0.172,P=0.098；注：男性赋值为1,女性赋值为0)；与患者年龄无显著相关性(r=-0.099,P=0.357、r=-0.032,P=0.771)；与肝组织病理学分级、分期之间分别无显著相关性和呈显著负相关(雌激素受体αmRNA:rs=-0.085,P=0.436和rs=-0.012,P=0.913；雄激素受体mRNA:rs=-0.243,P=0.023和rs=-0.326,P=0.002)；与肝组织胶原纤维面积比分别无显著相关性和呈负相关(r=-0.051,P=0.702、r=-0.108,P=0.051)；与肝组织HBsAg表达强度无显著相关性(rs=0.143,P=0.184、rs=0.199,P=0.063),与肝组织HBcAg表达强度分别无显著相关性(rs=-0.169,P20.116、rs=-0.085,P=0.430)。2肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量在肝组织病理分级和分期、肝组织之间的差异肝组织内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量在不同病理学分级之间的差异有统计学意义(F=30.056, P=0.000、F=45.819, P-0.000);在不同病理学分期之间的差异有统计学意义(F=17.796, P=0.000、F=20.570, P=0.000)。外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量在不同病理学分级之间的差异无统计学意义(F=0.180, P=0.836、F=2.577, P=0.082);雌激素受体αmRNA含量在不同病理学分级之间的差异无统计学意义(F=0.052,P=0.984),雄激素受体mRNA含量在不同病理学分期之间的差异有统计学意义(F=3.434,P=0.021)。3性别、年龄、肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体含量预测肝组织不同病理学分级、分期的Byes逐步判别分析以性别、年龄、肝组织内和肝组织内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量为自变量,肝组织病理学分级、分期为因变量,进行Byes逐步判别分析。结果,只有雄激素受体mRNA符合模型自变量纳入标准,进入判别模型。基于雄激素受体的判别肝组织不同病理学分级的Fisher判别函数为：G1=-0.298+2.852×雄激素受体mRNA含量,G2=-1.208-0.098x雄激素受体mRNA含量,G3=-1.892-2.925x雄激素受体mRNA含量。基于雄激素受体的判别肝组织不同病理学分级的Fisher判别函数判别G1、G2、G3的正确率分别为88.9%、12.2%、49.0%。基于雄激素受体的判别肝组织不同病理学分期的Fisher判别函数为：S1=-1.413+3.148x雄激素受体mRNA含量,S2=-1.028+0.931×雄激素受体mRNA含量,S3=-2.542-2.215×雄激素受体mRNA含量,S4=-1.685-1.855×雄激素受体mRNA含量。基于雄激素受体的判别肝组织不同病理学分期的Fisher判别函数判别S1、S2、S3、S4的正确率分别为48.0%、59.5%、0%和28.9%。以性别、年龄、肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体a、雄激素受体mRNA含量为自变量,肝组织病理学分级、分期为因变量,进行Byes逐步判别分析。结果,没有一项指标符合模型自变量纳入标准,进入判别模型。4肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体a、雄激素受体mRNA含量预测肝组织胶原纤维面积比的曲线估计以肝组织内雌激素受体α、雄激素受体mRNA含量为自变量,肝组织胶原纤维面积比为因变量,进行曲线拟合。结果,基于雌受体amRNA含量预测肝组织胶原纤维面积比的回归模型的决定系数中,三次方模型的决定系数最大(R2=0.094)肝组织胶原纤维面积比=0.187-0.128x雌激素受体amRNA含量+0.081×雌激素受体αmRNA含量2+0.073×雌激素受体αmRNA含量3。基于雄激素受体mRNA含量预测肝组织胶原纤维面积比的回归模型的决定系数中,三次方模型的决定系数最大(R2=0.202)；肝组织胶原纤维面积比=0.311-2.692×雄激素受体mRNA含量+7.818×雄激素受体mRNA含量2-9.765x雄激素受体mRNA含量3。以外周血单个核细胞内雌激素受体a、雄激素受体mRNA含量为自变量,肝组织胶原纤维面积比为因变量,进行曲线拟合。结果,基于雌激素受体α、雄激素受体nRNA含量预测肝组织胶原纤维面积比的回归模型不成立。结论1肝组织内雌激素受体a、雄激素受体表达水平与性别和年龄有关,男性患者雌激素受体a、雄激素受体表达水平低于女性患者；青春期及青春期后,随着年龄增长,肝组织内雌激素受体α、雄激素受体表达水平逐步降低。肝组织内雌激素受体α、雄激素受体表达可能参与慢性乙型肝炎发病和进展,肝组织内雌激素受体a、雄激素受体表达水平越低,肝组织炎症活动度和纤维化程度越高。肝组织内雄激素受体可能促进HBcAg表达。2外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体表达水平与性别和年龄无关。外周血单个核细胞内雄激素受体表达参与慢性乙型肝炎进展,外周血单个核细胞内雄激素受体表达水平越低,肝组织纤维化程度越高。外周血单个核细胞内雄激素受体表达不影响肝组织内HBcAg表达。3肝组织内和外周血单个核细胞内雌激素受体α、雄激素受体表达水平不平行；其中青春期及青春期后,肝组织内雌激素受体α、雄激素受体表达减少可能参与CHB发病和进展。肝组织内雌激素受体α、雄激素受体表达减少参与慢性乙型肝炎发病和进展的机制不完全依赖于乙型肝炎病毒的复制和抗原表达。