研究目的:肥胖问题日益受到社会重视,针对肥胖的预防和治疗,运动及其调节机体适应性的相关机制也逐渐被揭示。由于白色脂肪棕色化机制的提出,运动与白色脂肪棕色化的研究也逐渐深入,运动可以促进白色脂肪棕色化,促进机体的能量消耗、改善糖脂代谢并达到减肥的目的。外泌体因其具有远距离信号通讯作用,并可以作用于全身的特性成为近年来的研究热点。外泌体组成成分十分丰富,可包括蛋白质,核酸,脂质等。目前,已有国内外研究证实,运动训练促进人和啮齿动物外泌体释放,如有氧运动,慢性耐力运动以及阻力运动等均可使机体产生大量外泌体分泌和释放,外泌体通过自身组成成分的改变,发挥其生物学效应,从而调节机体对运动的适应性,并且国内外有研究证明,外泌体中miRNA表达的改变对机体具有非常重要的调节作用。circRNA是近年来发现的单链调节RNA分子,在人类疾病中起着关键作用,并显示出作为生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。有研究者认为,circRNA可以通过外泌体与目标因子结合,从而发挥生物学活性,但是运动训练与circRNA作用机制的相关研究较少见。因此,本研究基于运动可以促进外泌体的释放增加的证据,以及结合运动促进白色脂肪棕色化过程,提出分析运动是否通过改变外泌体中circRNA的表达,从而参与运动促进白色脂肪组织棕色化的相关机制的新思路。本研究以小鼠为研究对象,通过对正常小鼠进行中等强度跑台运动训练,分析运动对小鼠白色脂肪棕色化改变,进一步通过血浆外泌体测序分析,筛选运动引起血浆外泌体组成成分中发生差异表达改变的circRNA并进行验证,分析外泌体中circRNA对白色脂肪棕色化的作用机制,结合在体实验及离体实验进行证明,从而探索运动促进白色脂肪组织棕色化的新机制,为后期运动对抗肥胖的治疗提出新的研究视角及提供新的理论依据。研究方法:本实验分为两部分第一部分BALB/C小鼠于5周龄运动4周,分析小鼠运动训练对白色脂肪组织棕色化的影响;小鼠末次运动结束24h后收集血浆样本,超速离心法分离血浆中外泌体,透射电镜观察,蛋白免疫印迹鉴定外泌体;原代培养小鼠白色脂肪细胞,检测运动训练后外泌体对白色脂肪细胞的影响;运动训练后血浆外泌体与对照组外泌体进行高通量测序分析差异circRNA;实时定量PCR技术检测外泌体和组织中cir cRNA的水平。第二部分采用双荧光素酶报告基因系统和蛋白免疫印迹技术确定特定circRNA靶基因及其相关作用蛋白。在体注射修饰的脂肪特异性腺相关病毒（AAV）下调或者上调白色脂肪组织特定circRNA水平。采用GraphPad Prism软件进行统计学分析。研究结果:第一部分1.1与安静组（SE）相比,运动组（EX）小鼠体重增加程度显著性降低;组织形态学观察,EX组可见脂肪细胞体积明显减小,脂肪组织内脂肪细胞单位面积下数量增多;免疫组化染色可见UCP1蛋白表达于细胞膜,经UCP1抗体处理后,EX组细胞膜UCP1蛋白免疫组化染色可见深棕色染色增加;对SE组与EX组白色脂肪组织棕色化相关基因表达进性分析发现,UCP1、CIDEA、PPARγ、C OX7a1、COX8b、PRDM16的mRNA表达在两组间存在显著性差异（p<0.05）;对UCP1蛋白表达情况分析发现,EX组较SE组UCP1蛋白表达量增加,其差异具有统计学意义（p<0.05）。1.2外泌体蛋白测定结果显示,提取的SE组与EX组外泌体,其表面均有标记物CD9,TSE101,CD63蛋白的表达。1.3原代皮下白色脂肪细胞与SE组小鼠提取的外泌体共孵育（SE-exo）后,以及与EX组小鼠提取的外泌体共孵育（EX-exo）后,后者PRDM16和UCP1表达显著性增加,差异存在统计学意义（p<0.05）。1.4高通量测序分析血浆外泌体circRNA,SE组与EX组血浆外泌体测序后差异表达circRNA,以|logFC|>2且p value<0.05为临界值,EX组与SE组比较124个上调circRNA,134个下调circRNA,进一步对差异表达排前20位的c ircRNA随机选取10个进行验证,这结果与芯片中表达一致（p<0.05）,最终确定表达差异倍数最高的circRNA进行下一步研究。第二部分2.1生物信息学分析与circRNA₀011487作用的miRNA,选取可信度最高的miRNA进行验证。circRNA₀011487与miR-328-3p荧光原位杂交,NC组荧光素酶活性显著高于circRNA-WT与miR-328-3p mimics共转染组（p<0.05）,在Mut组中则无显著性差异,双荧光素酶实验确定circRNA₀011487表达水平的改变影响miR-328-3p的表达,与阴性对照组相比,PRDM16与miR-328-3pmimics共转染组荧光素酶活性度显著降低（P<0.05）,PRDM16-Mut共转染组荧光素酶活性无明显改变。circRNA₀011487与miR-328-3p表达水平的改变影响PRDM16基因表达,sh-circRNA₀011487转染后,PRDM16 mRNA表达显著性降低（p<0.05）。miR-328-3p的抑制剂对这种PRDM16 mRNA表达降低的情况有一定的削减或抑制作用（p<0.05）;miR-328-3p mimics可以使细胞中PRDM16的mRNA表达显著性低于对照组（p<0.05）;miR-328-3p mimics与过表达circRN A₀011487共同作用于细胞后,PRDM16的mRNA并未显著性低于对照组。棕色化标志性蛋白检测,与NC组相比,转染sh-circRNA₀011487能够降低PRD M16与UCP1的表达,差异存在统计学意义（p<0.05）,在共转染miR-328-3p inhi bitor后不存在显著性差异。转染miR-328-3p mimics可降低PRDM16和UCP1的表达,差异存在统计学意义（p<0.05）,与circRNA₀011487 OE共转染则不存在显著性差异。2.2在体注射携带sh-circRNA₀011487序列的腺相关病毒,恢复一周后进行4周运动,运动后白色脂肪组织中circ₀011487表达显著性增加,miR-328-3p表达显著性降低（p<0.05）,与SE组相比较,EX组小鼠白色脂肪棕色化标志性蛋白UCP1、CIDEA、PPARγ、COX7a1、COX8b、PRDM16的表达显著增加（p<0.05）;与EX+NC组比较,EX+sh-circ₀011487组则显著性降低了PRDM16和UCP1的蛋白表达水平（p<0.05）。circRNA₀011487可以与脂肪细胞miR-328-3p发生海绵结合作用,从而解除miR-328-3p对PRDM16的抑制作用,促进小鼠白色脂肪棕色化。研究结论:1小鼠运动训练后外泌体中circRNA表达存在差异,这可能与运动训练的作用有关。2 circRNA₀011487与miR-328-3p结合,解除了miR-328-3p对PRDM16的抑制作用,促进脂肪棕色化作用,促进米色细胞的生成,为运动对机体的长期作用效应提供新思路。