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本研究旨在(1)用人类单核肿瘤细胞株U937建立新型泡沫细胞模型;(2)黄芩茎叶总黄酮(TF)对单核细胞生长的影响;(3)TF对泡沫细胞形成的影响。进而初步探索黄酮抗动脉硬化的机制,并为开发利用承德丰富的黄芩资源提供理论依据。
研究方法:(1)为了建立U937巨噬细胞源性泡沫细胞模型,8瓶U937细胞分成对照组4瓶和模型组4瓶,细胞密度106个/ml,对照组细胞培养液中含胎牛血清(FCS)10%、LDL100mg/L,模型组培养液中另加佛波酯(PMA)100μg/L,37℃、5%CO2、饱和湿度培养72小时,收集细胞涂片用油红O染色观察细胞形态,并测定细胞内总胆固醇含量;(2)为了观察TF对U937细胞生长的影响,取2块24孔板,每孔中接种U937细胞5×104个/ml,培养液中含10%FCS和不同浓度的TF,根据TF浓度不同分为六组,分别是TF0mg/L、TF25mg/L、TF50mg/L、TF100mg/L、TF150mg/L、TF200mg/L组,每组接种8孔,37℃、5%CO2、饱和湿度培养7天,在此期间每24小时一次测定每孔的细胞密度,绘制细胞生长曲线。第7天测定细胞悬液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;(3)为了观察TF对泡沫细胞形成的影响,取2块24孔板,每孔中接种U937细胞2.5×106个/ml,培养液中含FCS10%、LDL100mg/L、PMA100μg/L和不同浓度的TF,根据TF浓度不同分为六组,分别是TF0mg/L、TF25mg/L、TF50mg/L、TF100mg/L、TF150mg/L、TF200mg/L组,每组8孔,37℃、5%CO2、饱和湿度培养72小时,收集培养细胞测定细胞内总胆固醇(TCH)含量和蛋白质定量,细胞涂片油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,并测定细胞培养液中Ox-LDL的浓度。
研究结果:(1)模型组细胞内大量油红O染色阳性的脂质颗粒,而对照组细胞形态无变化,细胞内无脂质颗粒。模型组细胞内TCH520.13±37.52mg/g蛋白,高于对照组39.47±9.26mg/g蛋白,两组差别有显著性(t=35.18p<0.001)。(2)TF25-200mg/L各组生长曲线均低于TF0mg/L组,细胞增殖减缓,TF0-150mg/L各组细胞培养液中LDH与细胞密度比值分别为6.19±0.41、5.92±0.93、10.16±0.42、5.44±0.28、4.14±0.64,差别无显著性,而TF200mg/L组细胞培养液中LDH与细胞数比值为58.13±8.96,高于其它各组,差别具有显著性(F=131.176p<0.001)。(3)油红O染色形态学显示,细胞内脂质颗粒随TF浓度的增加而呈减少趋势,细胞内TCH含量(mg/g蛋白)由高到低顺序排列分别为TF0mg/L(520.13±37.52)、TF25mg/L(375.39±39.78)、TF50mg/L(366.49±35.76)、TF150mg/L(263.55±27.72)、TF100mg/L(254.26±25.55)、TF200mg/L(249.23±22.69)mg/g蛋白,差别具有显著性(F=86.36p<0.001)。TF0-25mg/L时细胞培养液中Ox-LDL浓度分别为21.13±2.30和19.38±4.50,高于TF50-200mg/L组(分别为12.88±4.09,12.38±1.30,8.50±2.07,14.29±5.33μg/d1),差别有极显著性(F=40.73p<0.0001)。
研究结论:(1)新型U937巨噬细胞源性泡沫细胞模型建立成功;(2)TF具有抑制U937细胞生长增殖的作用,但TF浓度在200mg/L时,对体外培养的单核细胞可能具有毒性作用;(3)TF具有减缓巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用;(4)TF抑制单核细胞的增殖和抑制LDL氧化可能是TF减缓巨噬细胞源性泡沫细胞形成进而抑制动脉硬化形成的机制之一。