【摘 要】
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环状GMP-AMP合成酶（cyclicGMP-AMP synthase,cGAS）可识别胞质DNA激活Ⅰ型干扰素产生,在调节抗病毒天然免疫应答中发挥重要作用。本课题组前期研究发现鸡贫血病毒（Chicken anemia virus,CAV）衣壳蛋白VP1可靶向cGAS-STING（stimulator of interferon genes）信号通路中接头分子IRF7,从而抑制IFN-β表达,作为
【基金项目】
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安徽省自然科学基金面上项目“鸡贫血病毒VP1蛋白调控cGAS-STING信号通路干扰IFN-β表达的作用机制”（批准号2108085MC115）；
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环状GMP-AMP合成酶（cyclicGMP-AMP synthase,cGAS）可识别胞质DNA激活Ⅰ型干扰素产生,在调节抗病毒天然免疫应答中发挥重要作用。本课题组前期研究发现鸡贫血病毒（Chicken anemia virus,CAV）衣壳蛋白VP1可靶向cGAS-STING（stimulator of interferon genes）信号通路中接头分子IRF7,从而抑制IFN-β表达,作为VP1辅助蛋白的VP2是否发挥相似作用尚不清楚。本研究拟探明CAV-VP2靶向cGAS-STING信号通路调控IFN-β表达的分子途径,为进一步揭示CAV影响IFN-β表达的分子机制提供依据。1.VP2对IFN-β表达的调控作用首先构建真核表达重组质粒pm Cherry-C1-VP2并将其转染鸡巨噬细胞HD11,应用实时荧光定量PCR检测转染0~36 h内VP2和IFN-β的转录水平;共转染p CMV-Myc-VP2与IFN-β启动子表达质粒（IFN-β-luc）,并以p CMV-Myc-VP1质粒和IFN-β-luc共转染为参照,采用双荧光素酶报告基因检测系统分析在干扰素刺激DNA（ISD）刺激下VP2对IFN-β基因启动活性的影响。结果显示,在过表达VP2后,细胞中IFN-βm RNA水平显著上调,并在24~36 h达到极显著,这表明VP2能够增强IFN-β的转录表达。与VP1作用相反,VP2明显促进IFN-β基因的启动活性,需进一步分析VP2作用于cGAS-STING通路中何种信号分子从而影响IFN-β产生。2.VP2对cGAS-STING信号通路中接头分子的基因活性影响为进一步探明与VP2互作的cGAS-STING信号通路中接头分子,本研究将p CMV-Myc-VP2转染鸡成纤维细胞DF-1,应用双荧光素酶报告基因系统检测VP2对cGAS-STING信号通路中cGAS启动子（cGAS-luc）、STING启动子（STING-luc）、TBK1启动子（TBK1-luc）和IRF7启动子（IRF7-luc）活性的影响。结果显示,VP2可显著激活cGAS-luc和STING-luc,而对TBK1-luc和IRF7-luc活性无明显影响。这提示VP2调控的靶分子可能是cGAS或STING。3.VP2与接头分子互作对IFN-β表达的影响通过构建真核表达质粒p CMV-HA-VP2,并将其与p CMV-Myc-cGAS或p CMV-Myc-STING共转染至HEK293T细胞,运用Co-IP方法分析后显示,VP2可以同cGAS或STING结合并发生共沉淀。继而以pm Cherry-C1-VP2与p EGFPC1-cGAS或p EGFP-C1-STING质粒共转染细胞,显示VP2只与cGAS存在共定位。鉴于此,继而以VP2为诱饵蛋白,运用Pull-down方法分析后发现,VP2结合cGAS但不结合STING。由此表明,VP2与cGAS-STING信号通路中直接互作的靶分子为cGAS。过表达VP2和cGAS,通过双抗夹心ELISA检测IFN-β蛋白水平。结果显示,与cGAS单独刺激相比,VP2与cGAS共转染能显著上调IFN-β。这表明,VP2可促进cGAS诱导IFN-β的表达。综上所述,本研究明确了VP2靶向cGAS调控cGAS-STING信号通路从而促进IFN-β的表达。研究结果为进一步揭示鸡贫血病毒不同编码蛋白调控cGASSTING信号通路影响IFN-β表达的作用机理奠定了基础。
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