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研究目的1.探讨Yap在小鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤(Unilateral Ischemic reperfusion injury,UIRI)导致肾纤维化的模型中的表达;2.细胞水平探讨Yap基因对肾成纤维细胞活化和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白表达的影响;3.探讨不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶(Polyacrylamide hydrogel,PAHG)对成纤维细胞Yap、肌成纤维细胞标记蛋白SMA-α、ECM蛋白表达的影响;4.探讨CTGF基因对成纤维细胞活化和Yap、ECM蛋白表达的影响,明确Yap/CTGF通路是否调控肾成纤维细胞的活化。研究方法1.清洁级雄性野生型C57/B6小鼠随机分为3组,每组6只。手术组用微型血管夹阻断左侧肾脏血流45min,分别在术后1周和4周收集肾脏,假手术组4周收集肾脏。PAS、HE化学染色检测肾脏组织结构,PASM、Masson染色检测胶原蛋白,免疫组织化学染色和WB(western blot)检测肾脏组织Yap、CTGF、SMA-α、Fn、Col 1蛋白表达水平。2.分离肾成纤维细胞体外培养,WB检测TGF-β1诱导成纤维细胞活化后Yap、CTGF、SMA-α、Fn、Col 1蛋白表达水平;慢病毒过表达载体Yap(5SA)和敲除载体sg-Yap分别转染成纤维细胞,WB检测CTGF、SMA-α、Fn、Col 1蛋白表达水平。采用不同verteporfin浓度来抑制Yap转录功能,WB检测CTGF、SMA-α、Fn、Col 1蛋白以及细胞凋亡标记物caspase3、cleaved caspase蛋白表达水平;利用慢病毒载体TEAD(Δ289)-Myc转染成纤维细胞来阻断Yap与TEAD结合,TGF-β1(4ng/ml)诱导成纤维细胞24h,WB检测CTGF、SMA-α、Col 1蛋白表达水平。3.通过改变双丙烯酰胺和丙烯酰胺配比浓度来调节水凝胶的模量,制作不同刚度的基质水凝胶培养成纤维细胞,WB检测Yap、CTGF、SMA-α、Fn、Col 1蛋白表达水平;免疫荧光染色检测F-actin、SMA-α、Yap的表达定位。对不同刚度基质上培养的成纤维细胞,采用sg-Yap、TEAD(Δ289)-Myc和verteporfin来抑制Yap表达后,WB检测Yap、CTGF、SMA-α、Fn、Col 1表达。4.外源性CTGF(50μg/ml)孵育在不同刚度基质上培养的成纤维细胞,显微镜观察细胞生长形态;不同CTGF浓度孵育成纤维细胞以及慢病毒敲除载体sg-CTGF转染成纤维细胞,WB检测Yap、SMA-α、Col 1蛋白表达水平。研究结果1.Yap在小鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤模型中表达UIRI手术组4周后肾脏病理结果显示:肾脏结构紊乱,肾小管数量减少,管腔扩张、变形,小管上皮细胞萎缩,肾间质增宽、大量细胞浸润、胶原沉积;WB检测结果显示:UIRI肾组织中Yap及其靶蛋白CTGF、肌成纤维细胞标记蛋白SMA-α、ECM蛋白Fn和Col 1的表达增加,以4周组最明显,与假手术组相比差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色显示:UIRI 4周组肾间质中有SMA-α和FSP-1表达阳性的肌成纤维细胞浸润,Fn和Col 1表达增加,Yap在肾间质细胞及肾小管上皮细胞内强阳性表达,主要位于细胞核内。2.Yap对肾成纤维细胞活化和ECM蛋白表达的影响TGF-β1诱导肾成纤维细胞活化后,SMA-α、Fn、Col 1、Yap及CTGF的蛋白表达显著增加,并具有浓度梯度依赖性;过表达Yap(5SA)可诱导成纤维细胞活化上调SMA-α、CTGF、Col 1蛋白的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);利用sg-Yap敲除成纤维细胞中Yap基因后,SMA-α、CTGF、Fn和Col 1的表达明显降低,与TGF-β1刺激组相比差异有统计学意义(P<0.05);分别采用慢病毒TEAD(Δ289)-Myc质粒及药物verteporfin抑制Yap信号,均能显著抑制在TGF-β1作用下SMA-α、CTGF、Fn和Col 1的蛋白表达,与单纯TGF-β1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.细胞外基质刚度对成纤维细胞活化和Yap表达的影响显微镜下结果显示:硬基质(50k Pa)促进细胞快速生长增殖,细胞伸出伪足呈星形,软基质(0.5k Pa)细胞呈圆形、团簇状,易脱落,生长增殖受限。免疫荧光结果显示:在软基质中成纤维细胞SMA-α呈阴性表达,不产生丝状应力纤维,Yap表达位于细胞质;在硬基质SMA-α表达阳性,Yap大量表达于细胞核内。WB结果显示:随着凝胶基质刚度增大,成纤维细胞活化作用越明显,表达Yap、CTGF、Col 1、SMA-α蛋白增加,刚度达到50k Pa时作用最强。敲除sg-Yap基因阻断了硬基质对成纤维细胞的活化作用,蛋白Col 1、CTGF、SMA-α的表达减少,与硬基质对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);同样,TEAD(Δ289)-Myc和verteporfin抑制Yap信号也阻断了硬基质对成纤维细胞的激活作用,SMA-α、CTGF、Fn的表达减少,与硬基质对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。高硬度基质激活Yap表达、促进成纤维细胞活化以及ECM蛋白表达,抑制Yap信号能阻断高硬度基质对成纤维细胞的活化作用。4.CTGF对肾成纤维细胞活化和ECM蛋白表达的影响外源性CTGF能明显促进软基质培养的成纤维细胞增殖生长;CTGF诱导成纤维细胞Yap、SMA-α、Col 1蛋白表达增加,并随着CTGF浓度的提高蛋白表达增加;敲除CTGF基因(sg-CTGF)阻断了TGF-β1对成纤维细胞的促纤维化效应,蛋白Yap、SMA-α、Fn、Col 1的表达减少,与TGF-β1组相比差异有统计学意义(P<0.05)。CTGF调控成纤维细胞的活化。结论Yap激活促进成纤维细胞的活化和ECM蛋白合成;而抑制Yap表达阻断了细胞外基质力学对成纤维细胞的活化作用;敲除Yap的下游CTGF抑制了TGF-β1对成纤维细胞的活化作用。因此,通过干预Yap信号来调控成纤维细胞的活化、增殖、合成,将会给抗肾脏纤维化的治疗提供新的思路。