【背景及目的】肝豆状核变性(Wilson disease, WD)是常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病,发病率约为3/10万。WD好发于青少年,其病因是由于ATP7B基因突变导致ATP7B功能出现缺陷,不能清除体内多余的铜,导致铜在肝脏等组织中沉积。临床上以慢性肝脏病变、肾脏功能损害以及神经系统障碍等症状为主。但WD的铜代谢障碍起源于肝脏,主要异常部位也在肝脏,50%以上的病人临床表现为肝功能减退、肝中过多的铜引起的病理改变主要为肝细胞坏死、门静脉及其周围炎症和纤维化。目前对铜沉积在肝脏引起肝脏损伤的具体机制还不明确,国内外的研究表明凋亡在此损伤过程中起着重要的作用,但是其具体的调节机制并不明确。Bcl-2家族调控蛋白比例的失衡在多种原因引起的肝细胞凋亡的调节过程中都是一个中心环节,但是该家族是否参与了WD肝损伤的过程及其具体的调节机制还不是很清楚。目前常用于WD研究的动物模型有多种,如LEC大鼠,TX小鼠以及ATP7B基因敲除小鼠,但各模型与WD的病理生理改变并不完全一致,价格昂贵且不易得到,使其进一步的研究受限。本研究的目的在于建立一种简便、可靠的铜过量负荷动物模型,以进一步研究WD铜沉积导致肝脏损伤的发病机理,为WD的临床治疗提供理论依据。【方法】1.将大鼠随机分为对照组(A组),铜负荷4周组(B组),铜负荷8周组(C组),铜负荷12周组(D组),所有大鼠均按标准饲养12周,A组正常饮食,B组、C组、D组分别从第9周、第5周和第1周起给予含硫酸铜1g/kg的饲料和含0.185%硫酸铜的水。所有大鼠于12周末取血清及肝组织用于检测。2.采用原子吸收分光光度计测量各实验组大鼠血清及肝组织的铜含量。采用生化分析仪检测各实验组血清转氨酶ALT水平。3.采用TUNEL法检测各实验组大鼠肝细胞凋亡现象,并计算其凋亡指数(AI)。4.采用RT-PCR法检测各实验组大鼠肝组织中Bcl-2和Bax mRNA表达水平,并利用凝胶成像分析系统进行了半定量分析。5.采用免疫组化方法检测各实验组大鼠病理组织切片中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平,并通过图文分析系统进行蛋白表达的半定量分析。【结果】1.铜过量负荷后,大鼠血清及肝组织中的铜含量逐渐升高,12周达到最高水平(血清铜为16.43±4.51 mg/kg,肝组织铜为4.53±0.44 mg/kg)。2.铜过量负荷后,大鼠血清ALT水平逐渐升高,12周达到最高水平(200.50±16.15 U/L)。3.随着铜负荷时间的延长,肝细胞的凋亡逐渐增多,即肝细胞凋亡指数逐步升高,铜负荷12周凋亡指数达到最高水平(AI=19.8±1.2%)。4.各铜负荷组大鼠与对照组相比,肝组织Bax的mRNA表达水平明显高于对照组,且随着铜负荷时间的延长有升高趋势,Bcl-2的mRNA表达水平高于对照组,随铜负荷时间的延长也有升高趋势,但升高幅度低于Bax,故mRNA水平Bcl-2与Bax的比值(Bcl/Bax)随铜负荷时间延长逐步降低。肝组织Bax和Bcl-2的蛋白表达水平与mRNA表达水平的变化基本相一致,故蛋白水平Bcl-2与Bax的比值(Bcl/Bax)随铜负荷时间延长逐步降低。【结论】1.本研究成功建立了铜过量负荷大鼠模型,该模型可用于研究铜过量沉积导致肝损伤的发病机理。2.本研究发现铜过量沉积大鼠肝组织可以诱发大量肝细胞凋亡的发生,同时也检测到随着铜负荷时间的延长,Bax/Bcl-2水平逐步升高,推测肝铜沉积引起肝损伤,其机制可能为通过相对上调促凋亡基因Bax水平来诱导肝细胞的凋亡。