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背景和目的:肝肺综合征（Hepatopulmonary syndrome,HPS）作为一种终末期慢性肝病患者的严重并发症,在晚期肝硬化患者中的发生率约为5%-32%。临床特征主要为:排除原发性肺疾患后的三联征——基础肝脏疾病、肺内血管扩张（Intrapulmonary vasodilation,IPVD）和动脉血氧合功能障碍。其可能的发病机制主要有肺内微血管的异常扩张以及肺血管重塑（Pulmonary vascular remodeling,PVR）,但至今尚未完全阐明。肺部的病理生理异常离不开细胞功能的改变,我们团队早期研究发现,在HPS疾病模型动物肺微血管内皮细胞（Pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）中,存在异常增殖和迁移的现象,这似乎与内皮细胞的肌样分化有关。前期研究还发现,在胆总管结扎（Chronic bile duct ligation,CBDL）大鼠模型中,PMVECs从规则的单层上皮状态转变为一种无序的多层生长状态,但仅仅用肌样分化的概念,就还不能完全解释这种现象。而在许多研究中发现,“细胞极性（Cell polarity）”的建立和维持对细胞的发育、分化和功能维系至关重要,参与细胞的增殖、迁移和黏附。那么,在HPS中,会不会存在肺微血管内皮的“极性丢失”,从而导致了细胞的无序排列及生长,并最终导致肺微血管结构的改变引起肺氧合障碍呢?本研究的前一部分通过观察PMVECs极性蛋白的分布以及单层细胞电阻率（Transendothelial electrical resistance,TEER）的测定,初步提示HPS病程中存在“PMVECs细胞极性丢失”。而后,对于肿瘤的一些公开的报道显示,磷酸酯酶与张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog,PTEN）作为一种具有磷酸化酶功能的抑癌基因,不仅参与细胞生长、凋亡、粘附、迁移、浸润等过程,而且在细胞极性方面也具有重要调控作用。而细胞分裂周期蛋白42（Celldivisioncycle42,Cdc42）作为Rho蛋白家族中的小分子GTP酶发挥着调控细胞内极化信号通路的关键作用。我们怀疑PTEN/Cdc42通路可能参与了肺微血管重塑过程中PMVECs极性丢失的过程。本研究拟证实HPS血清通过PTEN/Cdc42信号通路引起PMVECs的极性丢失,从而参与了肺微血管重塑的病理过程。方法:1.HPS大鼠模型构建并制备血清,大鼠原代PMVECs培养及鉴定。采用CBDL法进行HPS大鼠模型的构建,分别构建假手术组（Sham组）、CBDL术后1周（CBDL-1w）、2周（CBDL-2w）、3周（CBDL-3w）、4周（CBDL-4w）各组,采集动脉血进行血气分析,肺组织切片行HE染色并制备各组血清。培养原代PMVECs（采用组织块法）,免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）法染色对内皮细胞进行特异性抗原鉴定。2.大鼠肺组织血管内皮细胞极性蛋白的定位检测,大鼠血清刺激后PMVECs极性蛋白分布及细胞膜电阻率的变化测定。免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测Sham组及CBDL-4w组大鼠肺组织及血清刺激后PMVECs内极性蛋白Podocalyxin（PCX）、β-catenin及gp200的分布情况。分别测定Sham组及CBDL-4w组大鼠血清刺激后PMVECs在0h、3h、6h、9h、12h、30h、36h单层细胞膜电阻率的变化。3.检测HPS大鼠肺组织内PTEN及Cdc42活性的变化,检测PTEN特异性抑制剂Bpv（pic）对Cdc42活性的影响。对Sham组大鼠及CBDL1-4w各组大鼠肺组织采用Western blot法检测p-PTEN及总PTEN水平的表达,采用蛋白质体外结合实验（Pull-down实验）检测Cdc42活性。PTEN特异性抑制剂Bpv（pic）预处理PMVECs,检测其在大鼠血清刺激24h后对Cdc42活性的影响。4.检测Cdc42抑制剂CASIN对PMVECs极性蛋白分布、细胞骨架蛋白、细胞迁移及增殖的影响。将PMVECs分为Sham组与CBDL组,分别用Sham组或CBDL-4w组大鼠血清刺激,每组加入5μmol/L的Cdc42特异性抑制剂（CASIN+）或无血清培养基（CASIN-）。处理24h后,IF检测PMVECs细胞极性蛋白PCX及gp200的分布;用FITC标记的鬼笔环肽（phalloidin）检测细胞骨架蛋白F-actin的变化;Transwell实验检测细胞迁移的影响;Ki-67荧光染色检测细胞增殖能力的影响。5.检测膜联蛋白A2（Annexin A2,AX2）参与PTEN/Cdc42途径在PMVECs细胞极性丢失过程中所起的作用。用小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）转染技术沉默PMVECs中的膜联蛋白A2基因,24h后验证转染效率,48h后用Pull-down法检测Cdc42活性的变化。结果:1.HPS大鼠建模情况、大鼠肺组织切片染色、PMVECs体外培养鉴定:（1）与Sham组比较,CBDL大鼠血气分析结果显示PaO2降低（P<0.05）,P（A-a）DO2增加（P<0.05）;（2）显微镜下观察,CBDL大鼠肺组织动脉壁增厚、微血管扩张明显;（3）免疫组织化学染色显示细胞CD31抗原阳性。2.HPS大鼠PMVECs极性蛋白的分布变化与膜电阻率的变化:（1）IF结果显示,Sham组的细胞极性蛋白PCX及gp200主要表达于PMVECs顶端管腔面,β-catenin主要分布于细胞的基底-侧面;而在CBDL组,这几种极性蛋白在血管内膜细胞发生了明显的异位,重新散在分布于细胞周围;（2）在血清处理3h、6h、9h后,与Sham组相比,CBDL组大鼠血清刺激的PMVECs细胞膜电阻率显著降低（P<0.05）。3.HPS大鼠肺组织内PTEN及Cdc42活性的变化:（1）与Sham组相比,CBDL组大鼠的p-PTEN及有活性的Cdc42表达均升高（P<0.05）;（2）运用PTEN抑制剂处理后,体外培养的PMVECs内Cdc42活性受到了抑制（P<0.05）。4.Cdc42抑制剂CASIN对PMVECs极性蛋白分布、细胞骨架蛋白、细胞迁移及增殖的影响:（1）CASIN处理24h后,CBDL组大鼠血清刺激后的PMVECs内极性蛋白PCX及gp200重新分布至细胞膜顶端面;（2）CBDL大鼠血清刺激下培养的PMVECs呈现不稳定的表型,具有较大的前缘片状伪足伴丝状伪足形成,FITC标记的鬼笔环肽显示细胞内肌动蛋白F-actin松散无序;CASIN处理后,PMVECs丝状及片状伪足恢复到正常状态,细胞内肌动蛋白表达增强;（3）与Sham组相比,CBDL组PMVECs细胞迁移和增殖能力增强（P<0.05）;CASIN处理后,CBDL组PMVECs迁移和增殖能力降低（P<0.05）。5.PTEN与AX2在PMVECs极性丢失过程中共定位,AX2在PMVECs细胞极性丢失过程中参与PTEN/Cdc42途径而发挥作用:（1）免疫共沉淀实验表明在PMVECs极性丢失的过程中,PTEN与AX2共定位表达;（2）用siRNA转染沉默膜联蛋白A2基因36h后,与无义转染对照组相比,PMVECs内Cdc42活性受到了抑制（P<0.05）。结论:（1）在与HPS相关的肺血管重塑过程中,PMVECs极性的丢失参与了其中;（2）这一极性丢失由增强的PTEN/AX2/Cdc42信号通路介导,下调其通路活性可以降低PMVECs对CDBL大鼠血清刺激引发的异常迁移和增殖能力,并恢复细胞的极性。