论文部分内容阅读
干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF-3)是调节Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)基因表达的关键转录因子,在固有免疫反应和获得性免疫反应中的起重要性作用。目前,国内外关于IRF-3的研究几乎全部集中在IRF-3参与的抗病毒自身免疫信号通路中的作用,而关于IRF-3的自身转录调控机制尚不十分清楚。生物信息学分析结果表明IRF-3第一内含子和第二内含子内有新的转录起始位点(transcription start site, TSS),表明该基因有多个启动子和多个剪接异构体,但现有文献未见该分子多个启动子鉴定和详细的剪接异构体分析的报道。本研究中通过5’末端快速cDNA末端扩增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE),发现IRF-3第二内含子内存在两个新的转录起始位点,分别位于第三外显子前718bp和162bp,与之对应的新的剪接异构体命名为intron 2 variant 1(Int2V1)和intron 2 variant 2(Int2V2)。RT-PCR发现二者在多数组织细胞中表达,并存在表达差异。为探索新的剪接异构体Int2V1的转录调控机制,分别克隆不同长度的5’侧翼启动子区域进行荧光素酶功能分析,发现Int2V1的核心启动子位于转录起始位点上游159~100bp之间,结合点突变、过表达和RNA干扰实验以及凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecitation, ChIP)证实转录因子特异性蛋白1(specificity protein, Sp1)是调节其启动子活性及mRNA水平的关键转录因子。EB病毒(Epstein-Barr varius)感染患儿外周血中Int2V1 mRNA水平较健康患儿低。病毒双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)类似物Poly(I:C)和双链DNA(double stranded DNA, dsDNA)类似物poly(dA:dT)转染293T细胞发现随着转染时间和剂量的增加Int2V1启动子活性随之增加。Poly(I:C)刺激组随时间延长Int2V1 mRNA表达量升高。poly(dA:dT)处理组,Int2V1在6-8小时表达量到达高峰,随后下降。本研究拓展了IRF-3启动子和剪接异构体的探索,完善了IRF-3转录调控的关键信息。