论文部分内容阅读
目的：观察槲皮素(Quercetin,QUE)对体外培养的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)缺氧缺糖(oxygen/glucose deprivation，OGD)损伤的保护作用，并探讨PI3K/Akt信号通路是否参与此过程。
方法：(1)新生1dSprague-Dawley(SD)大鼠大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后，采用恒温摇床振荡分离法和差速贴壁法纯化培养细胞，3d后行A2B5免疫细胞荧光染色和DAPI染色对细胞及纯度进行鉴定。(2)纯化的OPCs培养3d后，选用2mmol/LNa2S2O4联合低糖培养基建立细胞OGD模型，分别于损伤0.5h、1h和1.5h后在倒置显微镜下观察细胞形态；CCK-8法检测细胞相对存活率；流式细胞Annexin FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况；透射电镜观察损伤细胞超微结构。(3)观察QUE对培养3d后的OPCs存活率的影响，实验分为Control组、1μmol/LQUE组、3μmol/LQUE组、9μmol/LQUE组、27μmol/LQUE组、81μmol/LQUE组和100μmol/LQUE组，QUE处理细胞12h后CCK-8法检测细胞相对存活率。(4)观察QUE共孵育和预孵育对OGD损伤的OPCs保护作用，QUE共孵育法为2mmol/LNa2S2O4联合低糖培养基损伤OPCs的同时加入QUE;QUE预孵育法为QUE预处理OPCs3h后撤除QUE并行OGD损伤，以上损伤时间均为1.5h；两种孵育方法中OPCs均被分为七组即Control组；OGD组；OGD+QUE组，QUE终浓度分别为1μmol/L、3μmol/L、9μmol/L、27μmol/L和81μmol/L;CCK-8法检测OPCs相对存活率，LDH试剂盒检测LDH漏出量。(5)观察QUE共孵育对OGD损伤的OPCs保护作用，将OPCs分为Control组；OGD组；OGD+QUE组，QUE终浓度为3-81μmol/L，以E损伤时间均为1.5h；Hoechst33258染色检测OPCs核浓染率、流式细胞AnnexinFITC/PI双染法检测OPCs凋亡情况；Western blotting法检测凋亡及存活相关蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和p-Akt)的表达。(6)为进一步观察PI3K/Akt信号通路是否参与此保护过程，将OPCs分为Control组；OGD组；OGD+81μmol/LQUE组和OGD+81μmol/LQUE+LY294002组，以上损伤时间均为1.5h;Western blotting法检测p-Akt的表达。
结果：(1)细胞免疫荧光鉴定显示大多数细胞为A2B5阳性其纯度达98.14％。(2)2mmol/LNa2S2O4联合低糖培养基处理OPCs，形态学观察显示OGD损伤0.5h，大部分细胞突起回缩，胞体变圆，折光性下降，随损伤时间的延长，OPCs逐渐脱壁，1.5h时只有少数贴壁细胞。CCK-8法检测显示损伤0.5h、1h和1.5h组细胞的存活率显著降低，与Control组相比均有统计学差异(P＜0.05)；损伤1.5h组细胞存活率与0.5h组相比，具有统计学差异(P＜0.05)。Annexin FITC/PI双染法检测显示，与Control组相比损伤0.5h、1h和1.5h组的存活细胞相对数量均显著降低；而早期和晚期凋亡细胞的相对数量均显著增加；损伤1.5h组的存活细胞相对数量与0.5h组和1h组相比，均具有统计学差异（P＜0.05）。OPCs损伤1.5h后，电镜结果显示细胞线粒体肿胀，有些细胞胞核固缩成块，细胞器破碎。(3)CCK-8法检测1-100μmol/L的QUE对正常生长的OPCs相对存活率的影响，与Control组相比结果显示100μmol/L的QUE孵育OPCs12h后，细胞相对存活率显著降低（P＜0.01），1-81μmol/L的QUE用于后续实验。(4)CCK-8法检测QUE共孵育和预孵育对OGD损伤的OPCs保护作用，结果显示：3μmol/L、9μmol/L、27μmol/L和81μmol/L的QUE共孵育能显著提高OGD损伤的OPCs相对存活率，与OGD组相比均有统计学差异（P＜0.05），且相同浓度下共孵育比预孵育保护效果明显，具有统计学差异（P＜0.05）。LDH试剂盒检测结果显示：3μmol/L、9μmol/L、27μmol/L和81μmol/L的QUE共孵育能显著降低OGD损伤的OPCsLDH漏出量，与OGD组相比均有统计学差异(P＜0.05)，且相同浓度下共孵育比预孵育保护效果明显，具有统计学筹异(P＜0.05)。(5)QUE共孵育处理OGD损伤的OPCs后，Hoechst33258核染色结果显示3-81μmol/L的QUE能降低核浓染OPCs的相对数量，与OGD组相比均有统计学差异（P＜0.01），且随QUE浓度增加核浓染OPCs相对数量逐渐降低。Annexin FITC/PI双染法检测显示：3-81μmol/L的QUE能抑制OGD损伤的OPCs早期凋亡细胞相对数量，与OGD组相比均有统计学差异（P＜0.01），且随QUE浓度增加早期凋亡细胞相对数量逐渐降低。(6)Westernblotting结果显示：3-81μmol/L的QUE共孵育能显著降低Bax和cleaved-caspase-3的表达，提高Bcl-2和p-Akt的水平，与OGD组相比均有统计学差异（P＜0.05），且随QUE浓度增加Bax和cleaved-caspase-3的表达量逐渐降低，而Bcl-2和p-Akt的表达量逐渐增多。当用P13K特异性抑制剂LY294002预处理OPCs2h后，与OGD+81μmol/LQUE组比较OGD+81μmol/LQUE+LY294002组p-Akt的表达量显著降低，具有统计学差异(P＜0.01)。
结论：3-81μmol/LQUE可以显著降低Na2S2O4联合低糖培养基诱导的OPCs凋亡，随QUE浓度增加其保护作用增强，且PI3K/Akt信号通路参与了此保护作用。