含有NK4基因的重组腺病毒对人结肠癌抑制作用的研究

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肿瘤是当今社会威胁人类健康的重要疾病之一,结肠癌是消化道最常见肿瘤之一,现已成为我国消化系统第二常见肿瘤。近10年结肠癌的总体治愈率没有显著提高,其原因在于当原发肿瘤发现时,已有多数患者发生转移。而结肠癌根治术后仍有25%出现肝转移,这使结肠癌的5年生存率只接近40%。因此结肠癌患者的预后主要与有无转移有关,抑制转移将显著提高结肠癌治疗效果,提高患者生存率和生存质量。在肿瘤转移机制中,由基质成纤维细胞释放的肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)越来越引起人们的关注,它能对多种肿瘤细胞的转移行为产生影响。HGF最初是在肝细胞原代培养过程中发现是一种促细胞分裂剂,它是由69KD的α链(重链)和34KD(轻链)的β链通过一对二硫键相连组成。HGF的唯一受体是原癌基因c-Met的产物。HGF通过与c-Met受体的结合,组成HGF/c-Met信号转导通路,产生一系列生物调节效应:促进细胞增殖(mitogen),细胞运动(motogen),形态发生(morphogen)。当HGF/c-Met信号转导通路出现异常时,则对多种肿瘤的发生、生长、浸润、转移和血管形成有促进作用,所以对此通路阻断的研究将为抗肿瘤转移治疗提供新的靶点。 <WP=121>NK4是含有HGFα链N端447个氨基酸的片段,它可以与HGF竞争性地结合c-Met受体,但并不激活c-Met受体,从而阻断HGF/c-Met信号传导途径,抑制HGF诱导的肿瘤细胞侵袭转移过程。研究发现NK4具有双重活性,它不仅是HGF全面拮抗剂,全面阻断HGF所引起的细胞增殖、运动与形态发生,而且是血管生成抑制剂。作为血管生成抑制剂,NK4不仅能抑制由HGF所引起的促进血管生成活性,还可抑制由bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)所引发的血管新生促进活性。鉴于此,NK4用于肿瘤病人的临床治疗将必有一定潜力,已应用NK4对人类多种类型的肿瘤进行了实验室研究,取得良好结果,包括有胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌及卵巢癌等。肿瘤的基因治疗被认为是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗模式。由于腺病毒载体具有的诸多优点,现已成为在肿瘤基因治疗中应用最多的病毒载体。本研究利用第一代腺病毒载体AdEasy系统成功构建了含有NK4基因的非复制型重组型病毒rvAdCMV/NK4,并应用此重组腺病毒进行了对于人结肠癌细胞系LS174T的体外及体内功能实验研究。具体结果如下:含有NK4基因的重组腺病毒的构建及其生物学鉴定我们首先通过PCR从含有HGF全长cDNA序列的质粒中扩增出NK4基因片段,再利用腺病毒载体AdEasy系统通过细菌内同源重组的方法构建出含有NK4基因的重组非复制型腺病毒rvAdCMV/NK4。我们对此重组腺病毒进行形态学及分子生物学方面的鉴定,结果显示:rvAdCMV/NK4具有典型的腺病毒二十面体形态特征;RT-PCR证实NK4基因能在重组腺病毒中得到有效转录;western blotting证实NK4蛋白能在重组腺病毒中得到有效表达。含有NK4基因的重组腺病毒对人结肠癌细胞体外作用的研究 <WP=122>在此基础上,我们选用了具有HGF受体c-Met表达的人结肠癌细胞系LS174T作为实验研究对象,在体外细胞水平进行了有关NK4蛋白对HGF抑制作用的研究。我们首先用western blotting及间接免疫荧光法证实了NK4在重组腺病毒感染的LS174T细胞中的表达,并测定了rvAdCMV/NK4及对照病毒Ad-LacZ的感染滴度与体外细胞试验用感染复数。细胞体外增殖作用研究显示,重组腺病毒对细胞增殖无影响。在研究肿瘤细胞运动能力的细胞离散试验及细胞划痕实验中发现,重组腺病毒能拮抗由HGF所引致的细胞离散与迁移。在代表肿瘤细胞侵袭能力的细胞侵袭实验中,我们看到重组腺病毒能抑制HGF所诱导的肿瘤细胞对人工基底膜的侵袭作用。三、 含有NK4基因的重组腺病毒对人结肠癌体内作用的实验研究最后,我们构建了人结肠癌LS174T的裸鼠动物皮下及腹腔内种植肿瘤模型,以研究了重组腺病毒对肿瘤的体内作用。结果发现,重组腺病毒能抑制裸鼠皮下肿瘤的增长,表现为肿瘤体积的减小与瘤重的减轻;能抑制腹腔肿瘤细胞的种植,表现为腹腔播散灶数目减少、瘤重减轻。我们进一步利用免疫组化的方法,对肿瘤组织细胞进行了增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮细胞粘附分子-CD31及凋亡(TUNEL法)的检测,以期从核酸、蛋白质水平阐明NK4的一些抗肿瘤机制。结果分析显示,重组腺病毒对肿瘤细胞的增殖无影响,但可抑制肿瘤组织内新生血管的形成,并促进肿瘤细胞的凋亡。由此我们认为,含有NK4基因的重组腺病毒的抗肿瘤生长机制主要是通过它的血管生成抑制作用实现的,而抑制腹腔肿瘤细胞的种植是通过拮抗HGF作用实现的。本实验在国内首先利用腺病毒为NK4基因转移载体进行人结肠癌体外及体内的基因治疗研究,取得良好疗效,为开发具有我国自主知识产权的NK4基因治疗药物开辟了道路,为今后NK4进入肿瘤临床治疗奠定了实验基础,提供了理论依据。
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