棉花是世界上最重要的纤维作物,棉花生产与农业、手工业、贸易业等多个行业的发展关系十分密切,棉纤维的品质决定了棉花的商业生产价值。探讨棉纤维细胞伸长和次生壁合成的分子调控机理,对提高棉纤维品质具有重要的理论意义和实践价值。本实验室在先前的研究中鉴定了 5个LIM蛋白家族基因,获得GhWLIM5和GhXLIM6转基因棉花植株及其后代株系,本文主要对其中两个LIM蛋白在转基因棉花后代株系纤维发育中的功能及其调控机制进行了较为深入的探讨。此外,还对一个在棉纤维细胞次生壁发育时期优势表达的MYB类转录因子基因进行了初步分析,构建载体,转化棉花,获得该MYB基因的转基因棉花株系。本文获得的主要研究结果如下:1、抑制Gh WLIM5/GhXLIM6的表达阻碍棉纤维伸长发育为研究LIM蛋白在棉纤维发育中的功能,分析了GhWLIM 和GhXLIM6 RNAi转基因棉花后代株系的纤维长度变化等遗传表型。我们测量了不同RNAi棉花后代株系成熟棉纤维长度,统计分析结果显示,与野生型相比,转基因棉花成熟棉纤维长度都不同程度变短。进一步通过离体培养胚珠,测量发育中的棉纤维细胞长度,发现在纤维快速伸长期,转基因棉花纤维生长速度明显慢于野生型。上述结果说明GhWLIM5和GhXLIM6可能在棉纤维伸长阶段发挥正调控作用。2、GhWLIM5和GhXLIM6作为肌动蛋白结合蛋白促进棉纤维中肌动蛋白(F-actin)聚集成束在棉纤维发育过程中,F-actin维持一定聚合程度是必需的。用LatB(F-actin解聚剂)处理野生型棉花胚珠,导致棉纤维发育受阻。用Atto 488-鬼笔环肽对处于快速伸长期的棉纤维中F-actin进行染色观察,结果显示,与野生型棉纤维相比,GhWLIM5和GhXLIM6 RNAi转基因植株棉纤维中,肌动蛋白丝束更细,定量分析结果也显示,这些转基因棉纤维中F-actin聚合度更低。这些结果说明GhWLIM5和GhXLIM6都能够作为肌动蛋白结合蛋白,促进棉纤维细胞中F-actin丝束的形成,从而影响棉纤维伸长发育。3、GhWLIM5和GhXLIM6与F-actin结合能力以及促进F-actin聚合能力存在差异研究表明,不同LIM蛋白对F-actin的结合能力,以及促进F-actin的聚合能力可能存在差异。本文首先通过定量高速共沉淀实验,对GhWLIM5和GhXLIM6蛋白与F-actin的结合能力进行了比较。结果显示,在加入同样浓度的F-actin的情况下,GhXLIM6在沉淀中的比例更高,而GhWLIM5的沉淀量明显低于前者,这表明GhXLIM6与F-actin的结合能力更强。随后,采用低速共沉淀实验比较分析GhWLIM5和GhXLIM6促进F-actin聚合的能力,结果显示添加2μM GhXLIM6即可使70%低聚合度的F-actin聚合成高聚合度的F-actin丝束,而达到同样效果,GhWLIM5需要添加4μM,这说明GhXLIM6促进F-actin聚合的能力强于GhWLIM5。4、pH值对LIM蛋白促进F-actin聚合的影响研究表明,一些LIM蛋白促进F-actin聚合会受到pH值的影响。利用低速共沉淀实验,比较了在不同pH环境下上述两个LIM蛋白促进F-actin聚合的能力。结果显示,加入同样浓度的GhWLIM5,随着pH值下降,处于沉淀中的F-actin 比例不断上升,表明GhWLIM5促进F-actin的聚合受到pH值的影响,pH值越低,促聚合能力越强。相反,实验表明pH值的改变不影响GhXLIM6促进F-actin聚合的能力。5、棉花遗传转化及GhMYBL1转基因棉花植株的鉴定分离鉴定了一个在棉纤维细胞次生壁发育时期优势表达的MYB类转录因子基因,命名为GhMYBL1。构建了GhMYBL1过量表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的棉花转化,获得GhMYBL1过量表达和RNAi转基因棉花植株,并对T0代棉花苗进行了阳性鉴定。共获得了30个株系65棵阳性苗,移栽到大田或温室,进一步生长发育至成熟。有关GhMYBL1转基因棉花株系的遗传表型等方面的分析,正在进行中。6、GhMYBL1蛋白重组表达和多克隆抗体制备构建了pET28a-GhMYBL1的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达GhMYBL1蛋白,通过免疫家兔获取GhMYBL1多克隆抗体,Western Blot对抗体的特异性及效价进行了检测,表明该抗体可以用于后续相关的实验研究。