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我们分析了 RSV感染不同细胞所产生噬斑效果,并比较了不同覆盖介质对RSV感染引起噬斑效果的影响。通过观察发现,病毒在不同细胞上产生的病变效果不同:感染Hep-2细胞后3 dpi可见典型的细胞融合现象(合胞),而感染Vero细胞后7 dpi才见合胞现象但不典型不明显,14 dpi出现明显细胞脱落,最后感染Hela细胞后在3～4 dpi即出现细胞圆缩,细胞脱落快且无合胞现象。进一步,我们分析了不同覆盖介质对RSV感染Hep-2细胞产生噬斑直径和数目的影响,我们共试验了四种覆盖介质,包括经典常用的高粘度覆盖介质(即一种固体覆盖介质,琼脂糖)、经典常用的低粘度覆盖介质(即半固体覆盖介质,甲基纤维素MC和羧甲基纤维素CMC)、新型低粘度覆盖介质(尚未用于RSV研究的微晶纤维素,Avicel)。通过比较后,我们发现,琼脂糖覆盖介质组中噬斑直径与Avicel组无显著差别,但相同感染比例下噬斑数量少,约是Avicel组的20%,且在操作时要求技术人员掌握熔化后最适温度;MC覆盖介质组中细胞全部脱落,无可数噬斑形成;而CMC覆盖介质组中细胞噬斑直径过小,不便于观察和计数,与经典的免疫化学染色法出现的斑点信号几乎相同,而Avicel覆盖介质组中细胞噬斑直径较大且个数较多便于观察和计数。综上所述,我们发现Hep-2细胞是一种适合于分析RSV感染细胞噬斑的细胞系,新型覆盖介质Avicel从形成噬斑直径和数量来看均优于传统覆盖介质,可用于RSV噬斑分析,且不依赖于免疫细胞化学染色而是便捷快速的结晶紫染色法。本研究比较了三种低拷贝大容量的载体,包括pBeloBAC(拷贝数约为2)、pACNR1180(拷贝数在5以下,是严格的低拷贝)和p15A(拷贝数约为15)。首先通过Gibson重组酶将分段的RSV cDNA克隆进入不同载体,结果发现病毒基因组仅在pBeloBAC和pACNR1180载体中可保持完整性,而在p15A载体中出现2 kb基因(G和SH基因序列)的丢失。进一步,我们选择了 pACNR1 180-RSV cDNA重组质粒进行快速定点无缝克隆改造的研究,以缺失NS1基因为例,我们使用了三种不同的同源重组技术来实现1.5 kb PCR产物和15 kb重组质粒酶切产物的连接,包括依赖于不依赖基因序列和连接反应克隆法(SLIC)、Gibson组装和Red/ET重组技术,菌液PCR鉴定发现,SLIC组中连接成功阳性率为0,在Gibson组装中阳性率约25%,而在Red/ET组中阳性率约65%,因此,我们成功建立了基于Red/ET系统高效快速的RSV cDNA改造方法,进一步,我们使用该方法成功构建了 M2-2基因缺失以及NS1、M2-2基因共同缺失的RSV cDNA,用于下一步进行缺失基因对病毒毒力影响的研究。综上所述,本论文成功建立了便捷稳定的噬斑法检测RSV滴度以及基于Gibson组装快速构建RSV cDNA、基于Red/ET同源重组快速定点无缝克隆技术改造RSV cDNA的方法,为实验室以噬斑法检测RSV病毒滴度提供更便捷的方法,为实验室基础研究如基因功能研究等提供有利的分子手段,进一步可为疫苗研发中毒株毒力评定以及人为制造弱毒株提供可选方法。