研究背景和目的卵巢癌(ovariancancer,OC)是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位,但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位,对妇女生命造成严重威胁。近年来,卵巢癌在我国的发病率呈上升趋势,且趋向于年轻化。卵巢癌发病较为隐蔽,缺乏早期特异性的诊断方法,临床发现时多为中晚期。侵袭和转移是导致患者死亡的主要因素,腹腔内播散和远处转移是卵巢癌的主要转移途径。抑制癌细胞侵袭、转移成为卵巢癌临床治疗和基础研究的关键问题。肿瘤转移是指恶性肿瘤脱离原发肿瘤通过各种转移方式,到达继发组织或器官得以继续增殖生长,形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的全过程。它包括多个过程,其中肿瘤细胞侵袭是肿瘤转移的前提。近年来研究表明,肿瘤转移过程中肿瘤细胞需发生细胞形态和功能的改变,即上皮细胞间质转化,简称EMT(epithelial-mesenchymal transition)。在各种生理性或者病理性因素的影响下,上皮细胞逐渐丢失了细胞与细胞之间的紧密粘附连接,细胞形态逐渐从上皮样细胞状态向间质样细胞状态转变,继而使上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞。EMT以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征,表现为细胞黏附分子(E-钙黏蛋白)减少。这种表型的转换允许肿瘤细胞摆脱细胞与细胞间连接,而表现得更具侵袭性。EMT的发生涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制。可能与钙连接素、生长因子以及转录因子有关。钙连接素是一种跨膜糖蛋白,主要参与细胞间的连接,分为 E-cadherins,P-cadherins 和 N-cadherins 三种,而 E-cadherins 是其中影响肿瘤侵袭转移较重要的一种,同时,也是EMT的关键分子。E-cadherin维持稳定的细胞连接,抗E-cadherin抗体破坏细胞间连接,从而诱发EMT。但也有研究发现并不是所有的EMT均有E-cadherin的下调,还存在其他的机制参与EMT的发生。与E-cadherin作用相反,N-cadherin可促进肿瘤细胞迁移和转移,而且其作用超过E-cadherin介导的细胞间粘附作用。生长因子如HGF,FGF,EGF,TGF-β等,可与上皮细胞表面的相应受体结合,经不同的信号转导通路,影响细胞黏附分子与细胞骨架的功能。NF-κ B通路是在诱导和维持EMT的过程中极为关键。上皮细胞中抑制NF-κ B信号可以阻止Ras诱导EMT,而激活此通路促使EMT转变。此外,Snail,Slug,Sipl,AP-l,Twist等多种转录因子可以诱导EMT。总之,EMT是肿瘤转移的重要机制之一,但其调控机制仍不十分清楚,各种机制间的协同机制怎样?是否存在诱导EMT 一些新的始动因子?这些问题正成为EMT研究中的热点。而这些研究将为临床防治肿瘤转移提供新的思路和方法。一氧化氮(nitric oxide,NO)是氮的化合物,作为血管内皮活性因子和一种信号传递分子,具有广泛的生理病理作用,其在呼吸、循环、免疫、神经等全身多系统的生理,病理生理及有关临床疾病中起着重要作用。由于其独特的生物学活性及不稳定性,使得NO的研究主要集中在一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)上。一氧化氮合成酶(NOS)是催化NO生物合成的酶,专一催化L 一精氨酸转化为L 一瓜氨酸和NO,由于NO半衰期短,所以体内NO的生物作用完全依赖于NOS。NOS在体内广泛分布,其同工酶有三种亚型,即神经型一氧化氮合酶(nNOSorNOSl)、诱导型一氧化氮合酶(iNOSorNOS2)和内皮型一氧化氮合酶(eNOSorNOS3)。eNos存在于内皮细胞,心肌细胞和海马细胞;nNOS主要表达于神经元、骨骼肌和肺上皮细胞等,在正常生理条件下,各组织细胞的iNOS活性几乎不表达,只有受一些细胞因子的诱导而激活,如干扰素、肿瘤坏死因子一 a、脂多糖、白介素一1以及炎症因子。nNOS和eNOS合称为结构型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase,cNOS),在生理状态下产生低浓度和中等浓度水平的NO;NOS2主要由巨噬细胞产生并能够产生高浓度的NO。研究表明,NO的作用与其浓度相关,低浓度下发挥往往促进细胞增殖和抗凋亡作用,而高浓度时不利于细胞生长而诱导细胞凋亡。NOS在人和动物的多种实体肿瘤中过度表达。NO与肿瘤之间存在双重关系。持续低浓度NO(pmol～fmol)可以通过促进肿瘤细胞生长、参与肿瘤血管形成和抑制肿瘤细胞凋亡等,发挥促进肿瘤生长的作用。高浓度NO主要具有抗肿瘤作用,如介导巨噬细胞的杀肿瘤作用、激活p53而诱导肿瘤细胞凋亡等。一般而言,NO发挥抗肿瘤效应时的浓度要比促进肿瘤生长时的浓度高10～100倍。近年来,NO促进肿瘤的机制受到重视。胃肠道肿瘤、乳腺癌、膀胧癌以及头颈部肿瘤中均发现NOS的高表达,而且与肿瘤复发和转移相关。.NOS产物NO作为细胞间信号传递的重要调节因子,可促进血管内皮细胞分裂,诱导肿瘤血管生成,参与肿瘤的发生发展。然而NOS的促肿瘤转移作用是否还通过促进肿瘤细胞的EMT,而要打肿瘤细胞转移,还未见研究。证明NOS与EMT的关系,为肿瘤防治新的分子靶点,对治疗卵巢癌转移具有重要意义。本课题主要研究目标:NOS调控卵巢癌EMT的作用和机制,为卵巢癌治疗提供分子靶点。采用的方法和技术:根据公共资源GEO数据库中正常卵巢组织与卵巢癌组织的全基因表达谱数据,比较卵巢癌组织与正常卵巢组织的NOS基因的表达水平;分析NOS表达水平与卵巢癌的预后的相关性,从而明确NOS可能参与卵巢癌发生发展过程;利用NO抑制剂(L-NAME)抑制卵巢癌NOS蛋白的功能,明确NOS抑制对卵巢癌细胞生物学功能,特别是增殖、迁移功能的调控作用;检测NOS抑制后,卵巢癌EMT相关基因表达水平的变化,明确NOS对EMT的调控作用;利用RNA干扰技术和慢病毒载体技术,建立NOSl-shRNA转染的卵巢癌细胞株,观察NOS1沉默对卵巢癌细胞株增殖、迁移、侵袭的调控作用,从而验证NOS的促转移作用;通过全基因组表达谱芯片技术,检测NOS1沉默卵巢癌细胞株和其对照细胞株,通过比对筛选NOS1调控的基因。利用生物信息学方法探讨NOS1基因调控卵巢癌转移和EMT的机制信号传导通路和分子靶点。并利用westem blotting技术验证生物信息学筛选的NOS1调控的关键信号分子和靶点。明确NOS1调控卵巢癌转移可能的机制。结果1.NOS在人卵巢癌组织的表达分析:1)卵巢癌较正常卵巢组织高表达NOS:GEO数据库资料中,12对正常卵巢组织与卵巢癌组织芯片的比较结果显示:卵巢癌NOS1、NOS2和NOS3均表达高于正常卵巢组织,其中NOS1和NOS2有显著性差异(unpaired T-test,p-value:0.0009,0.0071)而NOS3 差异不显著。2)高表达NOS与卵巢癌预后呈负相关:250例卵巢癌组织芯片meta分析显示:NOS1和NOS2高表达的卵巢癌生存时间短,其中统计分析NOS1和 NOS2 相关显著性分别为 P=0.0561 和 P=0.0197(Log-rank Test),但 NOS3相关性无显著差异。提示NOS与卵巢癌生存相关,NOS可能参与了卵巢癌发生发展过程。2.NOS抑制剂(L-NAME)对卵巢癌细胞株SKOV3生物学功能的影响1)L-NAME抑制卵巢癌细胞增殖:处理的卵巢癌细胞株SKOV3,CCK8增殖实验显示L-NAME对卵巢癌细胞增殖(P<0.05);平板克隆形成实验显示L-NAME处理的卵巢癌的克隆形成率显著低于对照组(P<0.05),提示L-NAME抑制SKOV3细胞增殖能力。2)L-NAME抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭:划痕实验显示:L-NAME较对照组的细胞迁移能力明显减弱,差异具有显著性(P<0.05);Transwell小室实验证明L-NAME较对照组的细胞迁移能力明显减弱,差异具有显著性(P<0.05);3)L-NAME抑制卵巢癌细胞SKOV3的EMT功能:qRT-PCR检测SKOV3细胞加入 L-NAME 后 48 小时,N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 均表达下调(p<0.05,),而上皮质细胞标志物E-cadherin表达水平无显著差异。werstem blot发现:在SKOV3细胞加入L-NAME后48小时,E-cadherin蛋白表达水平显著上调(p<0.05),间质细胞标志物 N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 与 qRT-PCR 检测结果,均下调(p<0.05)。3.NOS1沉默对卵巢癌细胞生物学特性的影响1)NOS1沉默对细胞体外增殖的影响:卵巢癌细胞株SKOV3在NOS1沉默后(shNOS1-OV3),CCK8 法显示 shNOSl-OV3 较其对照细胞(conNOSl-OV3)增殖减慢(p=0.000)。平板克隆形成实验显示shNOS1-OV3克隆形成率比对照组显著减低(P<0.05)。2)NOS1沉默对细胞体外迁移的影响:划痕实验、Transwell小室实验和Boyden小室分别检测shNOSl-OV3迁移和侵袭能力显示:NOS1沉默后,卵巢癌细胞的迁移侵袭能力降低,(P-value均<0.05)。4.探讨NOS1调控EMT的分子机制1)生物信息学技术分析:NOS1-shRNA的稳转卵巢癌细胞株(shNOS1-OVCAR3)与对照细胞株(conNOS1-OVCAR3)进行基因表达谱芯片比对,共筛选出NOS1调控的基因1706 个(NOS1-genes),其中 EMT 相关基因 122 个(NOS1-EMT-genes)。生物信息学在线软件分析显示,NOS1-EMT-genes网络形成4个主要结点,涉及的主要分子功能为生长因子、PI3K/AKT、转录因子和细胞运动。主要涉及PI3K/AKT信号通路。2)生物信息学结果验证:利用Western blotting检测SKOV3细胞中PI3K/AKT信号通路活性的标志分子p-AKT和EMT转录因子smail,结果显示:L-NAME抑制,导致SKOV3的p-AKT和smail下调。验证了生物信息学结论,即卵巢癌细胞中NOS通过PI3K/AKT信号通路调控EMT功能,促进肿瘤转移。结论:1.卵巢癌中高表达NOS,与卵巢癌预后不良呈负相关;2.体外实验表明,卵巢癌细胞表达NOS,调控EMT功能,促进细胞增殖和迁移;3.NOSI通过PI3K/AKT通路调控卵巢癌细胞的EMT功能,从而促进肿瘤细胞迁移;