研究背景中药蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)的干燥体,是一味应用历史悠久的传统动物类中药。其性辛,味温,有毒,归肝经,具有息风止痉、解毒散结、通络止痛之功效,临床常用于治疗疔疮、小儿急慢惊风、诸疼痛、痈疽、抽搐、半身不遂、跌打损伤、瘿瘤瘰疬等症。现代研究发现其具有镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗惊厥、抗凝纤溶、调节免疫等药理作用,在治疗多种外科炎症、恶性肿瘤、糖尿病、癫痫、类风湿性关节炎、多种神经疼痛、血管栓塞性疾病等方面均取得了较好的疗效。中药配方颗粒,是在中医药理论指导下,以规范炮制加工的中药饮片为原料,采用提取,低温浓缩,快速干燥等技术而制成的颗粒剂。它即可供临床灵活组方,调配冲服,又可作为中药制剂的工业原料,也为中医临床用药提供新的方法。血栓栓塞性疾病是由血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引的疾病。该疾病临床非常常见,严重危害人民生命和健康,是现代社会主要的致死性疾病之一。弥漫性血管内凝血(DIC)是以血栓、栓塞、广泛出血、休克和溶血为主要临床特征的一种综合征,该病症预后差,死亡率高,属临床重症。近年研究发现蜈蚣在抗凝和溶栓方面发挥着独特的作用。由于蜈蚣药材传统用药方法剂量不准确,药物气味不易为患者接受,同时药材质量不稳定、贮存、携带运输均不方便,故将其制成质量稳定可靠、剂量准确、安全有效、服用方便、便于携带和贮藏运输的蜈蚣配方颗粒,不仅可以保证临床用药的方便、安全、有效,还可以扩大蜈蚣药材的应用范围。研究目的本课题通过研究蜈蚣药材质量控制方法,以此为基础优选蜈蚣配方颗粒剂制备工艺,并通过体内外抗凝溶栓药效研究对配方颗粒剂的制备工艺进行评价,为蜈蚣药材及配方颗粒成品质量的稳定、可控和临床用药的安全、有效提供科学依据,同时为相关研究提供可参考范例。研究方法蜈蚣药材质量控制方法研究:本课题选取同一产地4个不同批次的蜈蚣药材,根据2010版中国药典(一部)要求,分别对其来源、性状、水分、总灰分、醇浸出物进行考察;以薄层色谱鉴别作为蜈蚣原药材定性鉴别方法,精氨酸及丝氨酸作为对照标准,筛选药材供试品处理方法及展开溶剂系统;以凝血酶滴定法作为蜈蚣药材抗凝活性定量方法,筛选药材前处理方法。两种不同处理方法测得抗凝血酶活性结果以X±S表示,采用统计软件包SPSS13.0进行处理,若方差齐则采用两独立样本t检验,方差不齐时采用t’检验,判断两种方法之间是否存在显著差异,P<0.05表示差异有统计学意义。蜈蚣配方颗粒制备工艺优选:采用水提-酶解混合法提取药材中的有效成分。药材加磷酸缓冲液水浴加热提取,药渣加入人工肠液半仿生酶解,以单因素法筛选影响水提及酶解工艺的因素,正交设计优化水提及酶解工艺;采用正交设计优化浓缩干燥因素;采用湿法制颗粒。实验结果以X±S表示,单因素实验结果采用One-Way ANOVA进行统计学分析,正交试验结果采用General Linear Model中Univariat过程进行正交实验方差分析且不考虑各因素间交互效应,当方差齐时两两比较采用LSD检验,方差不齐时,采用Welch稳健估计,再采用Dunnett’s T3检验进行两两比较,P<0.05表示差异有统计学意义。娱蚣配方颗粒抗凝溶栓药效研究:本课题分别比较了蜈蚣药材、水提物及配方颗粒体外溶栓作用及对DIC小鼠模型的影响。体外溶栓实验:采集雌性SD大鼠动脉血,置于常温条件自然形成血栓块后,切割、随机分组,称重(W0)并按不同实验组分别加入阳性对照药(链激酶)、蜈蚣药粉混悬液、蜈蚣水提液、蜈蚣配方颗粒水溶液及生理盐水,分别于加药后2h及18h称量未溶解的血栓湿重W2及W18。以W0、W2、W18为指标,考察相同时间点,不同实验组药物体外溶栓能力的差异及同一实验组药物在不同测量时间点血栓湿重的变化。结果以X±S表示,采用General Linear Model中Repeated Measures过程对实验结果进行重复测量方差分析,并对各时间点血栓湿重的变化进行球对称假设检验(Mauchly’s test of sphericity),若检验结果P>0.05,则采用重复测量设计资料的方差分析;反之,P<0.05,则采用Greenhouse-Geisser方法进行校正。体内药效实验:研究蜈蚣药材、水提物及配方颗粒对DIC小鼠模型的影响,比较3种不同蜈蚣制剂在小鼠体内抗凝及溶栓活性的差异。以肝素钠及阿司匹林(ASP)作为阳性对照药物,内毒素脂多糖(LPS)作为造模药物,以造模后小鼠凝血时间(CT)、血小板计数(PLT)及血浆鱼精蛋白副凝固试验(3P)结果作为评价指标。选取昆明种小鼠,随机分为空白、模型、肝素钠、ASP、蜈蚣药粉、蜈蚣水提物及蜈蚣配方颗粒7个实验组,各组连续给予相应药物7d后,腹腔注射LPS造成小鼠急性DIC模型,造模结束后45min测定各实验组小鼠凝血时间(CT),并于造模结束后5h对各实验组小鼠摘眼球取血,用于血小板计数及血浆鱼精蛋白副凝固试验(3P)。CT及PLT测定结果以X ± S表示,采用One-Way ANOVA进行方差分析。当方差齐时两两比较采用LSD检验,方差不齐时采用Welch稳健估计,再采用Dunnett’sT3检验进行两两比较,P<0.05表示差异有统计学意义。3P试验结果以等级资料表示,7个实验组之间比较采用Kruskal-Wallis H检验,两两比较采用Mann-Whitney U检验,之后再进行Bonferroni校正,P<0.05表明差异有统计学意义。结果蜈蚣药材质量控制方法研究1.药材来源及性状:所选4个批次蜈蚣药材性状符合2010版中国药典(一部)要求;2.水分、总灰分及醇浸出物:4批药材总灰分含量分别为:4.81%、3.79%、3.28%、4.36%,醇浸出物含量分别为:37.10%、34.28%、38.62%、40.01%,均符合药典规定(总灰分≤5%,醇浸出物≥20%);3.薄层鉴别:以游离精氨酸、丝氨酸作为蜈蚣药材薄层鉴别的指标成分,药材经甲酸及95%乙醇(1:1)超声处理后,以正丁醇-乙酸-水(12:5:4)体系于硅胶G板上进行薄层层析,喷洒2%的茚三酮溶液后于60℃显色,此方法得到的斑点清晰,杂质及拖尾影响较小,目标成分分离度较好,样品中精、丝氨酸Rf值分别为:0.22、0.42;4.抗凝活性定量:以凝血酶滴定法测定蜈蚣药材抗凝活性,结果重现性较好,结果可靠;超声法提取药材中的抗凝成分,操作简单,耗时较短,提取率显著高于水提法(P<0.001);4批相同产地不同批次蜈蚣药材抗凝活性分别为:14.00±1.53U/g、13.00±0.58U/g、17.00±1.15U/g、15.67土 1.53U/g;范围在 12.42～18.15U/g。蜈蚣配方颗粒制备工艺优选取蜈蚣药材粉末,加入12倍0.02mol/L磷酸钠缓冲溶液(pH=7.0),65℃水浴加热浸提75min,浸提过程中时时搅拌。提取完毕后,提取液经150目纱布过滤,滤液保留,剩余药渣干燥后,按药渣10倍量加入人工肠液,37℃水浴中预温15min,加入占药渣量6%的胰蛋白酶,37℃酶解5h。酶解完毕后,酶解液经150目纱布过滤,滤液与水提所得滤液混合、离心(4000r/min,20min),上清液于50℃减压浓缩至0.5g/ml后,60℃真空干燥制成干膏。将干膏粉碎成80至120目细粉,加入少量环糊精和粘合剂制软材,软材经过筛、60℃干燥、整粒后,制成20至50目颗粒。所制得的颗粒每1g相当于原药材2g,粒度检查不合格率为:10.77%,水分含量为4.58%,平均抗凝活性为:69.00U/g。药效评价1.体外溶栓活性:蜈蚣药材、水提物及配方颗粒体外溶栓能力均随时间的延长而显著提高(P<0.001)。短时间内,蜈蚣配方颗粒各剂量体外溶栓能力与药材及其水提物相比无显著差异(P>0.05);长时间后,配方颗粒中、高剂量体外溶栓能力均显著高于药材及其水提物(P<0.05),且配方颗粒高剂量组体外溶栓能力与阳性药物链激酶无显著差异(P>0.05);药材经水提后,水提物体外溶栓能力与药材比较无显著差异(P>0.05);三种药物体外溶栓能力与剂量之间均存在量效关系,体外溶栓率随剂量增加而增大(P<0.001)。2.对DIC小鼠的影响:造模结束45min后,肝素钠、ASP、蜈蚣药材、水提物及配方颗粒在小鼠急性DIC早期均显著缩短小鼠凝血时间(P<0.001),各药物能力由低至高依次为:蜈蚣原药材<ASP<肝素钠<蜈蚣药材水提物<蜈蚣配方颗粒。造模结束5h后,蜈蚣药材、水提物及配方颗粒均能显著抑制血小板聚集,升高DIC小鼠血小板水平(P<0.05),其中蜈蚣配方颗粒在DIC小鼠体内抑制血小板聚集能力显著高于原药材及其水提物(P<0.05);蜈蚣药材、水提物对小鼠DIC模型后期继发性纤溶亢进均无显著影响(P>0.05),蜈蚣配方颗粒对对小鼠DIC模型后期继发性纤溶亢进有抑制作用(P<0.05)。结论蜈蚣药材质量控制方法研究:所选蜈蚣药材质量符合2010版药典相关规定,所筛选的薄层鉴别及抗凝活性定量方法可作为蜈蚣药材定性鉴别及定量方法;蜈蚣配方颗粒制备工艺优选:所筛选的制备工艺适合用于蜈蚣配方颗粒的制备;制得的配方颗粒剂量准确、不良气味减轻,粒度、水分含量均符合2010版药典(一部)规定,每1g配方颗粒相当于原药材2g;配方颗粒平均抗凝血酶活性为:69.00U/g。药效评价:蜈蚣药材配方颗粒体内外抗凝活性及体外溶栓活性均优于原药材,表明配方颗粒工艺合理。