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飞蝗是世界性农业害虫,在我国农业历史上蝗灾与水灾、旱灾一起,并称三大自然灾害。近半个世纪以来,长期的化学防治不仅使飞蝗产生了抗药性,并且化学农药的残留给生态环境带来严重污染。昆虫的体壁具有十分重要的保护作用和生理功能,体壁形成相对封闭的内环境,使得虫体内部结构得到外层屏障的保护,能够起到抑制水分蒸发和抵御外界环境影响等作用。蛋白质是昆虫体壁的重要组成成分,其成分的缺失或含量变化都会引起表皮功能异常甚至是功能丧失,从而影响昆虫的生长发育。本文基于课题组构建的飞蝗转录组数据库,搜索得到飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因序列,对其进行分子特性、基因表达和基于RNA干扰的功能研究。研究结果可为飞蝗防治探索新的分子靶标,为飞蝗有效控制提供新的思路与理论依据。一、飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的搜索、克隆及鉴定基于课题组构建的飞蝗转录组数据库,采用生物信息学方法搜索获得类似LmObst家族基因的cDNA片段,经过Blast分析,得到Obst家族基因的cDNA序列；设计扩增引物,采用RACE技术扩增得到该家族基因的全长cDNA序列；将得到的8个LmObst家族基因对应的氨基酸序列分别在SignalP在线软件和SMART网站进行蛋白的信号肽和其功能域分析,发现均具有LmObst家族表皮蛋白的特点,即1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2。同时使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) Obst家族基因和赤拟谷盗(Tribolium castaneum) CPAP3家族基因(Obst家族基因的同源基因)氨基酸序列进行序列比对,构建系统进化树,根据聚类分析结果,分别将上述基因命名为LmObst-Al、LmObst-A2、 LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。二、飞蝗Obstructor家族基因的时空表达根据得到的8个飞蝗LmObst家族基因的核苷酸序列,设计特异性引物,采用real-time quantitative PCR (qPCR)检测飞蝗8个表皮蛋白基因在飞蝗5龄若虫不同组织部位和5龄若虫不同发育时期的表达情况。qPCR结果显示飞蝗LmObsts家族基因在5龄若虫的7个不同组织部位均有表达,其中LmObst-E1和LmObst-E2在前腸和后肠特异性高表达,LmObst-D1在体壁和前肠表达量高,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达。LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势较为一致,即在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。三、飞蝗Obstructor家族基因的功能研究根据飞蝗LmObst家族基因的cDNA序列,设计含T7启动子的特异性双链引物,采用RNAi技术研究基因的生物学功能。首先于2龄若虫第2天分别注射3μg和10μg dsRNA,24 h后取样检测基因沉默效率,结果表明：3μg的注射剂量仅能沉默两个基因LmObst-A1和LmObst-D2的表达,10 μg dsRNA注射沉默了5个基因的表达,但仍然有3个基因LmObst-A2、LmObst-B和LmObst-C的表达未实现有效沉默。之后根据5龄若虫不同天数的表达图谱,选择表达量较低的时间点即5龄若虫第5天分别注射10μg dsRNA,在表达量较高时即48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低,全部基因得以成功沉默。进一步观察发现,注射dsLmObst-El的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20%若虫蜕皮延迟1 d,并且在蜕至成虫后很快死亡；其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但尚未发现其他可见的异常表型。综上所述,本文获得飞蝗8个表皮蛋白LmObst家族基因,所有LmObst家族蛋白均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2,功能域保守；时空表达图谱显示LmObsts基因可能参与飞蝗体壁和前后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。RNAi功能研究显示LmObst-El是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡。本文研究结果可为飞蝗生物防治探索新的分子靶标,为飞蝗有效控制提供新的思路与理论依据。