研究背景及目的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,每年新发病例数占全世界新发病例数的比例高达42.5%,居各种肿瘤发病率的第二位; HCC的死亡率约为20/100,000,已成为农村第一位和城市第二位的癌症死因。HCC具有转移早、临床症状出现晚的特点,70%患者确诊时已属晚期,丧失了手术时机,即使直径小于5cm的小肝癌,根治性切除后的3年复发率也高达40-50%,追其原因,肿瘤细胞的转移是阻碍进一步提高疗效的最大障碍。转移是恶性肿瘤的共同生物学特征,亦是导致肿瘤患者临床治疗预后差,易复发的主要原因;但由于肿瘤细胞转移及其调控的复杂性,至今我们对其发生的确切机制仍不清楚。因此,从分子水平阐明肿瘤转移机制可能为临床肿瘤的诊治提供新途径。KAI1/CD82基因于1995年首次被证实与肿瘤细胞的转移有关,其编码的跨膜糖蛋白具有调节细胞运动、黏附和抑制肿瘤细胞迁移、浸润的作用。在肝癌中,临床和实验证据都表明KAI1表达下调与转移灶的形成及患者预后不良密切相关,KAI1能使癌细胞转移能力明显减弱。目前,关于KAI1能够抑制肿瘤转移的认识已得到学者们普遍认同,但其调控肿瘤转移的具体作用机制仍不清楚。国外对KAI1基因作用机理的研究近年有逐渐增多的趋势,研究思路主要倾向于探讨KAI1对与肿瘤转移相关的信号分子和信号通路的影响,并已取得了一些初步的成果,但有关KAI1抑制癌细胞迁移的作用机制仍然不十分清楚。我们课题组最近发现KAI1可下调胰腺癌细胞内信号分子鞘氨醇激酶(SPK)的活性,为我们研究KAI1抑制肿瘤转移的信号转导机制奠定了初步的基础。SPK是调节细胞内神经酰胺(Ceramide,Cer)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate,S1P)水平的重要限速酶,可通过酶促反应维持二者的动态平衡,从而维持细胞的生理功能。Cer是一种负调控因子,抑制细胞生长、迁移、促进细胞凋亡;S1P是Cer的进一步代谢产物,是正调控因子,促进细胞增殖、分化、迁移和抑制凋亡。Cer和S1P——这两个鞘磷脂代谢产物的动态平衡决定了细胞状态的发展方向。近年来,研究表明SPK的活性受多种与肿瘤发生和转移密切相关的生长因子的调节,如血管内皮生长因子(VEGF)等,都可以通过MAPK等信号通路使SPK磷酸化,激活SPK,进而调节细胞内Cer和S1P的动态平衡发展方向,最终影响肿瘤细胞的增殖、凋亡以及迁移等生物学功能。因此,SPK也被认为是与肿瘤细胞生物学特性密切相关的生长因子信号传导途径中的一个重要信号分子。Sprouty2是MAPK信号通路的抑制因子,发挥抑制细胞增殖、分化及迁移等生物学效应。肿瘤细胞大多伴有该信号通路的异常,作为负反馈抑制因子——Sprouty2也被认为有可能是一种抑癌基因,且在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤细胞中已经证实了这一点。那么Sprouty2和SPK——这两个与肿瘤转移密切相关的信号分子是否参与了KAI1对肝癌细胞转移的抑制作用呢?本课题旨在探明KAI1对上述两个蛋白表达及酶活性的影响,以及KAI1、SPK和Sprouty2蛋白三者之间的作用关系,进一步探讨KAI1抑制肿瘤转移的信号转导途径。研究方法本研究采用肝癌细胞系SMMC-7721细胞为研究对象。应用本室构建的携带KAI1基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-KAI1),将该基因导入肝癌细胞,采用Transwell、划痕实验检测KAI1对HGF诱导肝癌细胞迁移的影响;应用MTT、流式细胞仪检测KAI1对SMMC-7721细胞增殖能力、凋亡以及细胞周期等生物学特性的作用;Western Blot检测KAI1对SPK蛋白表达的影响;同位素掺入放射自显影法检测对酶活性的作用;Transwell检测HGF诱导肝癌细胞迁移,以及同位素掺入放射自显影检测HGF对SPK的激活作用;用PI-3K、MAPK信号通路的特异性阻滞剂PD98059和LY294002预处理SMMC-7721细胞,观察是否能阻断HGF对SPK的激活作用,阐明HGF通过何种信号通路激活SPK;加入SPK特异性阻断剂DMS,观察是否能阻断HGF诱导肝癌细胞迁移,以证实SPK在HGF诱导迁移信号通路中的作用。Western Blot检测SMMC-7721细胞转染KAI1后Sprouty2蛋白的表达情况和MAPK的磷酸化水平;构建携带靶向Sprouty2 siRNA序列的慢病毒表达载体,PCR鉴定阳性克隆,感染SMMC-7721细胞,通过挑克隆和流式细胞分选仪筛选分离Sprouty2 RNA干涉阳性细胞株,以Western Blot检测Sprouty2干涉后的表达水平;观察Sprouty2功能沉默后,KAI1对SPK以及对HGF诱导肝癌SMMC-7721细胞转移的抑制作用是否能够被阻断或明显减弱。研究结果(1) KAI1抑制HGF诱导的人肝癌SMMC-7721细胞迁移。转染Ad-KAI1后,HGF诱导的细胞迁移受到明显的抑制,其未转染KAI1的迁移细胞数值为109.2±6.3,转染的迁移细胞数值为36.7±4.7,两者差异具有统计学意义(P<0.01),划痕实验结果也提示转染KAI1的SMMC-7721细胞迁移能力明显下降,未转染Ad-KAI1的细胞迁移了79.2±9.1%,而转染Ad-KAI1的细胞仅迁移27.2±5.1%,差异具有显著性(P<0.05);(2) KAI1对SMMC-7721细胞增殖、凋亡和细胞周期无明显影响。转染KAI1后细胞增殖受到轻度抑制,96h后测MTT相对OD值分别为:对照组3.33±0.19,50MOI组3.09±0.09,100MOI组2.95±0.13,150MOI组2.71±0.17,但差异不显著;转染KAI1后细胞凋亡变化不明显,四组的细胞凋亡比例分别为:5.08±0.97%,8.05±1.24%,7.15±1.19%和10.72±2.71%;细胞周期亦未见明显影响,结果显示:G1期细胞比例分别为:72.24%,70.55%,66.70%和68.63%;(3)转染KAI1后SMMC-7721细胞内SPK的蛋白表达及酶活性均受到明显抑制,将未转染KAI1的对照组设值为1,转染KAI1各组细胞SPK蛋白表达相对值分别为:50MOI组0.91±0.06,100MOI组0.64±0.03和150MOI组0.45±0.02,SPK酶活性的相对值分别为;0.83±0.04,0.76±0.02和0.59±0.06,KAI1对SPK的抑制作用存在剂量效应关系;(4) HGF激活SPK的酶活性。将未加HGF刺激的对照组细胞SPK酶活性设值为1,加入不同浓度HGF刺激的细胞SPK酶活性相对值分别为:1.82±0.09,2.16±0.07;3.41±0.11,升高明显,差异显著(P<0.05),且HGF对SPK的激活存在剂量效应关系;(5) HGF刺激诱导细胞迁移。未加HGF诱导的细胞迁移数只有19.3±2.9,25ng/mlHGF诱导迁移细胞数为97.2±7.1,50ng/mlHGF诱导迁移细胞数为115.87±17,差异具有统计学意义(P<0.01),诱导迁移作用呈明显的剂量效应依赖关系;(6) DMS阻断HGF诱导SMMC-7721细胞迁移。将肝癌细胞用SPK特异性阻滞剂DMS预处理,加入HGF诱导迁移,未加DMS的细胞迁移数为115.72±9.7,而加入DMS预处理的SMMC-7721细胞的迁移数目明显减少,为10.1±2.6,二者比较有显著性差异(P<0.01),DMS阻断HGF诱导迁移的作用;(7) PI-3K、MAPK信号通路阻滞剂对HGF激活SPK的影响。将SMMC-7721细胞用PI-3K、MAPK信号通路阻滞剂PD98059和LY294002预处理,加入HGF,未加处理的对照组SPK酶活性为2.82±0.18,加入PD98059和LY294002预处理的细胞SPK酶活性分别为0.49±0.03和0.38±0.07;(8) KAI1上调Sprouty2表达。转染Ad-KAI1上调SMMC-7721细胞中Sprouty2蛋白的表达,将未转染Ad-KAI1的对照组Sprouty2蛋白表达量设为1,转染各组相对值分别为:1.18±0.04,1.56±0.03和1.61±0.04, Ad-KAI1的感染强度与Sprouty 2的蛋白表达呈剂量依赖的正相关;(9) KAI1抑制MAPK磷酸化。转染Ad-KAI1抑制MAPK的磷酸化,将未转染Ad-KAI1的对照组MAPK磷酸化表达量设为1,其余转染的各组相对值分别为:0.84±0.04,0.72±0.06和0.44±0.06;(10)设计构建的靶向Sprouty2的siRNA慢病毒表达载体。PCR扩增鉴定阳性克隆,在与理论值相符的300 bp位置扩增出条带,证明重组慢病毒载体带有目的基因,将该表达载体转染细胞,Western Blot证实其对SMMC-7721细胞中Sprouty2的表达确有干涉作用,将未干涉的对照组Sprouty2蛋白表达量设为1,Sprouty2干涉细胞的蛋白表达量为0.35±0.01,差异显著(P<0.01);(11)沉默Sprouty2对KAI1抑制SPK的影响。采用RNAi沉默Sprouty2功能,发现未干涉Sprouty2的细胞KAI1使SPK活性降低达到60%左右,使SPK表达下降50%左右,而Sprouty2功能被干涉沉默后,KAI1对SPK活性的抑制率只有20%左右,对SPK表达的抑制率也只有10%,差异有统计学意义(酶活性:P<0.01;蛋白表达:P<0.05);(12)沉默Sprouty2对KAI1抑制癌细胞迁移的影响。在未干涉Sprouty2的细胞,KAI1能够明显抑制HGF诱导SMMC-7721细胞迁移,未转染KAI1迁移细胞数为156.50±9.66,转染KAI1的迁移细胞数只有41.25±2.86,差异显著(P<0.01);而Sprouty2功能被沉默后,KAI1对HGF诱导细胞迁移的抑制减弱,未转染KAI1迁移细胞数为161.41±4.85,转染KAI1的迁移细胞数也达到120.23±11.98,无明显差异(P>0.05)。研究结论(1) KAI1显著抑制HGF诱导的肝癌SMMC-7721细胞迁移,对该细胞系的细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响不明显;(2) KAI1抑制SMMC-7721细胞鞘氨醇激酶(SPK)蛋白表达和酶活性;(3) HGF通过PI3K、MAPK通路激活SPK来传递诱导SMMC-7721细胞迁移的信号,SPK是HGF诱导肝癌细胞迁移信号通路中的重要信号分子;(4) KAI1通过调控SMMC-7721细胞SPK的蛋白表达和酶活性,实现其抑制HGF诱导细胞迁移的作用;(5) KAI1能够上调SMMC-7721细胞的Sprouty2蛋白表达;(6) Sprouty2蛋白表达的上调参与了KAI1抑制SPK及KAI1抑制肝癌细胞迁移的信号转导机制。