碳骨架重排是自然界中化合物结构多样性和生物活性多样性的重要来源,受到人们的广泛关注。由于在碳骨架重排过程中形成的中间体很不稳定,大部分碳骨架重排机制还未得到清晰阐述。细菌来源的角环类芳香化合物由Ⅱ型聚酮合酶(PKS)负责合成,其碳骨架合成途径有两种,一种是聚酮中间体直接折叠而成,另一种经过碳骨架的重排生成,目前此类碳骨架重排尚未通过体外生化实验证实。村山醌系由链霉菌产生的一种芳香聚酮抗生素,分子中含有天然产物罕见的9,10-菲醌母核;不同于直链的9,10-蒽醌,9,10-菲醌的芳香环呈角形排列。早期同位素喂养实验表明村山醌由Ⅱ型PKS负责合成,并提示在生物合成过程中发生碳骨架重排现象。本研究利用高通量异源表达方法筛选获得在原始菌株中沉默的村山醌生物合成基因簇,在此基础上对村山醌合成过程中的碳骨架重排机制进行了研究。本研究确定了村山醌生物合成基因簇的边界和必需基因。村山醌生物合成基因簇由结构基因区域和调控基因区域组成,二者相距28kb。结构基因区域包括:mini PKS基因(mrqA、mrqB、mrqC),三个聚酮还原酶基因(mrqM、mrqF、mrqH),三个环化酶基因(mrqD、mrqE、mrqJ),八个氧化酶基因(mrqO1-mrqO8)和四个未知功能蛋白基因(mrqG、mrqK、mrqL、mrqI)。为了研究重排机制,本论文对村山醌生物合成基因进行了单基因敲除。从突变株中分离鉴定了三个蒽醌类直链芳香聚酮化合物。为了确定所积累的蒽醌类化合物是否为途径中间体,将其分别喂养到突变株ΔPKS中,发现只有一个蒽酮环氧化物能被转化为村山醌,表明其为途径中间体。ΔmrqO7和ΔmrqO6中能积累此化合物(ΔmrqO7积累量多而ΔmrqO6积累微量),说明MrqO7和MrqO6跟此化合物到终产物的转化有关。为了确定其它跟此蒽酮环氧化物到终产物转化相关的酶,将蒽酮环氧化物喂养到所有不产村山醌并且不积累此蒽酮环氧化物的突变株中,发现只有ΔmrqO3突变株不能将其转化为终产物,说明MrqO3也跟蒽酮环氧化物到终产物的转化有关。序列分析表明,MrqO7为NAD(P)H依赖的氧化还原酶,MrqO6为FAD依赖的氧化酶,MrqO3为胆固醇氧化酶的同源蛋白。为了验证这三个蛋白是否能够催化蒽酮环氧化物到村山醌的转化,用这三个蛋白进行体外酶促反应,体系中加入辅因子NADPH或者NADH。三个酶同时存在时,蒽酮环氧化物可以转化为村山醌;减少任意一个酶,村山醌都不能产生。为了阐明酶促反应顺序,反应体系中只加入一个酶和底物蒽酮环氧化物进行体外反应。结果显示MrqO7、MrqO6都可以消耗底物。LC-MS检测分析表明,MrqO6催化得到的产物比底物多了16 Da,暗示插入了一个氧原子;MrqO7催化得到的产物比底物多了2 Da,暗示插入了两个氢原子。MrqO3不能消耗底物,推测MrqO3催化最后一步反应。通过两步法酶促反应确定了MrqO7催化的反应先于MrqO6催化的反应。通过以上实验,推测蒽酮环氧化物转化为村山醌的反应途径为:MrqO7首先还原蒽酮环氧化物,打开环氧键,然后MrqO6催化中间体发生拜耳-维力格氧化反应,随后中间体碳-碳键断裂并且发生重排、缩合生成新的碳-碳键,最后MrqO3催化中间体发生氧化反应和还原反应,脱去两个水分子,生成村山醌。目前,直链芳香化合物生成角环芳香化合物重排过程中,此蒽酮环氧化物是唯一证实的中间体。由MrqO7、MrqO6和MrqO3催化的从蒽酮环氧化物到村山醌的转化,首次体外证实此类重排过程。本研究揭示了自然界中角环芳香化合物形成的新机制,为后续研究奠定基础。