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目的原发性肝癌是世界上恶性程度最高的肿瘤之一,发病率及病死率均很高,尽管手术和药物治疗有所改善,但复发和转移导致HCC患者的预后较差。前列腺素E2(PGE2)是细胞生长过程中的一种重要调节因子,它通过参与各种细胞代谢活动,从而介导多种生理和病理过程。PGE2通过与不同前列腺素E受体亚型结合,诱导肿瘤细胞的生长和细胞增殖,增强肿瘤细胞入侵和迁移,抑制肿瘤细胞凋亡,并促进肿瘤血管生成。前列腺素E受体包括EP1、EP2、EP3和EP4四种亚型,在四种受体中,EP3和EP4亲和力较EP1和EP2高。在肿瘤中,EP4受体是被研究的最为广泛和深入的EP受体亚型。其中EP4受体与多种人类癌细胞的增殖和侵袭相关,被报道是与人类肿瘤关系最密切的一种EP受体亚型。Snail是近年研究发现的一种抑制型转录因子。研究表明,Snail与E-cadherin基因启动子区结合而抑制后者的转录,通过影响细胞间黏附分子的表达,促进上皮间质转型而促进肿瘤的侵袭和转移,参与肿瘤的进展。c-myc是一种多功能的早期反应基因,具有广泛的生物学效应,调节细胞的增殖、分化和凋亡等过程。研究表明c-myc在多种恶性肿瘤中异常表达,影响肿瘤的增殖和转移,参与肿瘤的发生与进展。本研究旨在通过EP4受体选择性拮抗剂CJ-42794来探究PGE2/EP4信号对肝癌细胞生物学行为的影响以及其参与肝癌发生发展的分子机制,为原发性肝癌机制的研究提供实验依据以及为肝癌靶向治疗的相关药物研究提供靶点。方法HepG2和Huh7细胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM和1%青霉素/链霉素的完整培养基(高糖)中培养,培养基温度为37℃,加5%CO2的湿化培养箱。收集对数期生长的HepG2和Huh7细胞,常规消化后,以含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞,调整细胞浓度至5×104个·m L-1。以每孔100μL(3×103个)细胞接种96孔培养板中(重复3块),每组6个复孔,37℃,5%CO2条件下过夜。更换培养基,分别加入以下药物:对照组(加入相同体积溶媒)、PGE2组(分别加1μM、2μM、5μM PGE2),CJ-42794组(5μM PGE2+5μM CJ-42794),37℃,5%CO2条件下分别培养24 h和48 h,采用MTT法检测CJ-42794对肝癌细胞增殖的影响。取130μL DMEM滴于上室内使膜亲水。取不同加药组处理24 h后的HepG2细胞和Huh7细胞常规消化离心,用1 m L无血清DMEM培养基重悬细胞并计数,分别取2×104个细胞加入600μL含30%FBS DMEM培养液,即每组最后的细胞数相同。吸去上室内无血清DMEM培养基,将含有2×104个细胞的细胞悬液混匀,缓慢逐滴垂直加入小室中,置于细胞培养箱内培养,期间动态观察细胞穿膜情况,48 h后采用transwell法检测CJ-42794对肝癌细胞侵袭的影响,重复3次实验。细胞加药处理24 h后,收集细胞采用RIPA裂解液提取蛋白,4°裂解30 min,13200 rpm离心25 min,得到上清液。然后用BCA试剂盒检测蛋白浓度。采用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,并将蛋白转移到PVDF膜,将PVDF膜放于5%脱脂奶粉室温封闭1h,随后添加一抗(c-myc1:1000;snail1:1000)和小鼠单克隆anti-β-actin(1:500)4°过夜孵育,然后将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1 h,采用western-blot法检测CJ-42794对肝癌细胞c-myc和Snail表达的影响。结果1.CJ-42794对肝癌细胞增殖的影响:HepG2刺激24 h后,与对照组比较,2μM PGE2、5μM PGE2和CJ-42794组的细胞增殖率显著升高,且5μM PGE2组升高最显著(P<0.05)。与5μM PGE2组比较,CJ-42794组细胞增值率降低,但无显著统计学意义(P>0.05)。HepG2刺激48 h后,与对照组比较,2μM PGE2和5μM PGE2组的细胞增殖率显著升高,且5μM PGE2组升高最显著(P<0.05)。分别与2μM PGE2组和5μM PGE2组比较,CJ-42794刺激组的细胞增殖率显著降低(P<0.05)。Huh7刺激24 h后,与对照组比较,2μM PGE2、5μM PGE2和CJ-42794组的细胞增殖率显著升高,且5μM PGE2组升高最显著(P<0.05)。与5μM PGE2组比较,CJ-42794组细胞增值率降低显著降低(P<0.05)。Huh7刺激48 h后,与对照组相比,5μM PGE2组的细胞增殖率显著升高(P<0.05)。分别与2μM PGE2和5μM PGE2组比较,CJ-42794刺激组的细胞增殖率显著降低(P<0.05)。2.CJ-42794对肝癌细胞侵袭的影响:结果显示,HepG2细胞,与对照组比较,PGE2各刺激组的细胞侵袭率均显著升高(P<0.05),与PGE2(2μM、5μM)组比较,CJ-4279组的细胞侵袭率显著抑制(P<0.05)。Huh7细胞,与对照组比较,2μM PGE2、5μM PGE2组的细胞侵袭率显著升高(P<0.05)。与PGE2(2μM、5μM)组比较,CJ-4279组的细胞侵袭率显著抑制(P<0.05)。两种细胞结果一致,提示PGE2通过EP4受体调控肝癌细胞的侵袭能力。3.CJ-42794对肝癌细胞c-myc表达的影响:c-myc通过上调许多靶基因的表达从而促进细胞增殖和肿瘤发生,是机体重要的原癌基因之一。为了探索CJ-42794是否介导肝癌中PGE2/EP4R信号,我们采用western-blot的方法检测了CJ-42794处理对HepG2和Huh7细胞中c-myc表达的影响。结果显示,与对照组比较,PGE2组细胞中c-myc的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。而CJ-42794明显抑制了PGE2促c-myc蛋白表达的效应,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示PGE2/EP4对肝癌细胞生物学行为的影响可能与c-myc原癌基因有关。4.CJ-42794对肝癌细胞Snail表达的影响:Snail是一种与肿瘤发生发展密切相关的转录因子,通过影响细胞间黏附分子的表达从而促进肿瘤细胞的转移和侵袭。为了阐明CJ-42794影响肝癌细胞生物学行为的分子机制,我们采用western-blot的方法检测了CJ-42794处理对肝癌细胞中Snail表达的影响。使用1μM、2μM、5μM PGE2和5μM(PGE2+CJ-42794)分别处理HepG2和Huh7细胞,作用24h。Western blot结果显示,与对照组比较,PGE2组细胞的Snail蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与PGE2组比较,CJ-42794组细胞的Snail蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。这些数据表明PGE2诱导的HCC细胞增殖受Snail的调控。以上结果提示PGE2/EP4R对肝癌细胞生物学行为的影响可能与c-myc原癌基因有关。结论EP4受体选择性拮抗剂CJ-42794抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制肝癌细胞中c-myc和Snail的表达,提示PGE2可能通过EP4受体介导的c-myc和(或)Snail信号来影响肝癌细胞的生物学行为,从而参与调节肝癌的发生与发展,有望为原发性肝癌机制的研究提供实验依据以及为肝癌靶向治疗的相关药物研究提供靶点。