Toll样受体（Toll like receptors,TLR）是动物和植物中普遍存在的免疫识别分子,在机体的免疫防御和稳态维持中发挥着重要作用。TLR识别配体后,通过My D88（髓样分化因子88）依赖和My D88非依赖信号通路向下游传递信号,诱导促炎细胞因子和I型干扰素的产生。目前,在人类和小鼠中分别有10个和12个TLR被鉴定,它们分布在细胞的不同部位,具有显著差异的配体识别特征并引起不同的免疫应答反应。相比而言,显著扩张的TLR家族成员在无脊椎动物的基因组中被发现,例如在长牡蛎（Crassostrea gigas）中发现了83个TLR和10个My D88。这提示无脊椎动物的固有免疫防御机制更加复杂,但它们在免疫应答中的具体作用尚未完全了解。软体动物长牡蛎是潮间带生物的典型代表和世界上贝类养殖的主要品种,具有重要的生态与经济价值。随着基因组的解析,长牡蛎已逐渐成为研究病原-宿主相互作用的优良模式生物。本研究以长牡蛎为对象,采用生物信息学分析、ELISA和生物膜干涉等技术手段,从长牡蛎中鉴定了3个TLR信号关键元件（CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s）,初步探究了长牡蛎TLR信号的分子结构特征、结合活性、表达特征以及免疫功能,以期解析TLR信号对长牡蛎炎症因子的调节作用。取得的主要研究结果如下:1.长牡蛎CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s的分子结构特征从长牡蛎基因组中筛选出1个TLR（命名为CgTLR2）和两个接头分子My D88（分别命名为CgMyD88-2和CgMyD88s）基因。CgTLR2基因的编码框长度为2289 bp,能编码含762个氨基酸残基组成的多肽,预测其蛋白分子量为88.9 k Da。CgTLR2含有TLR家族的保守结构域,包括胞外段8个LRR结构域,1个跨膜结构域,以及1个胞内段TIR结构域。CgMyD88-2基因的编码框长度为1845 bp,能编码含457个氨基酸残基组成的多肽,预测其蛋白分子量为50.9 k Da。CgMyD88-2蛋白包含1个N端的Death结构域和1个C端的TIR结构域,结构完整。CgMyD88s基因的编码框长度为1107 bp,能编码含178个氨基酸残基组成的多肽,预测其蛋白分子量为20.7 k Da。CgMyD88s蛋白只包含1个C端TIR结构域,N端Death结构域缺失。利用MEGAX软件构建CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s的进化树,结果表明3个基因在进化上均较为保守。2.长牡蛎CgTLR2对配体及接头蛋白的结合活性通过原核表达与亲和纯化技术,分别获得了CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s的重组蛋白（r CgTLR2-LRR、r CgTLR2-TIR、r CgMyD88-2、r CgMyD88s）,并利用重组蛋白分别制备了高特异性多克隆抗体。利用ELISA方法检测了r CgTLR2-LRR与不同PAMPs配体的结合活性,发现CgTLR2对LPS、MAN和poly（I:C）的结合活性呈剂量依赖型,与LPS的亲和力最高,而与MAN和poly（I:C）的亲和力较低。利用生物膜干涉方法,检测r CgTLR2-TIR与r CgMyD88-2和r CgMyD88s之间的结合活性,发现r CgTLR2与二者均有结合。将其结合曲线进行拟合,得到CgTLR2与CgMyD88-2的结合常数（KD）值为1.96×10-9M,CgTLR2与CgMyD88s的结合常数（KD）值为4.84×10-8 M,表明CgTLR2与CgMyD88-2的结合能力更强。ELISA实验进一步证明了CgTLR2与CgMyD88-2的亲和力高于与CgMyD88s的亲和力。3.长牡蛎CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s的表达特征利用免疫组织化学方法,检测CgTLR2在长牡蛎血淋巴细胞中的定位发现,CgTLR2分布在血淋巴细胞的细胞膜上。利用荧光定量PCR方法,检测了3个TLR信号元件的表达特征,发现CgTLR2的m RNA转录本在血淋巴细胞、外套膜、鳃、肌肉、肝胰腺和唇瓣中均有表达,在血淋巴细胞中表达最高,为鳃中表达量的30.35倍。CgMyD88-2和CgMyD88s在各组织中呈组成型表达并在鳃中表达最高。其中,CgMyD88-2在鳃中的表达量是肝胰腺中表达量的3.17倍,CgMyD88s鳃中的表达量是唇瓣中表达量的45.51倍。进一步分析其在不同类型血淋巴细胞中的表达发现,CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s的m RNA在颗粒细胞、半颗粒细胞和无粒细胞中均有表达,但在颗粒细胞中的表达量最高,在无粒细胞中表达量最低,在颗粒细胞中的表达量分别为在无粒细胞中的8.25倍、13.76倍和43.27倍。接着检测灿烂弧菌刺激后的时序表达发现,CgTLR2的m RNA表达水平在灿烂弧菌刺激后的3 h开始逐渐升高,6 h时表达量最高,为对照组的2.80倍（p<0.001）。Cg IL17-1的m RNA表达水平也在灿烂弧菌刺激后的3 h开始逐渐升高,6 h表达量最高,分别为对照组的12.55倍（p<0.001）和21.42倍（p<0.001）。CgMyD88-2的m RNA表达水平同样在灿烂弧菌刺激后的3 h和6 h时显著增加,分别为对照组的5.18倍（p<0.001）和7.55倍（p<0.001）。CgMyD88s的m RNA表达水平直至灿烂弧菌刺激后的24 h开始有升高的趋势,在48 h表达量达到最高,为对照组的35.99倍（p<0.001）。CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s均在二次灿烂弧菌刺激（VS-VS）后高表达,其表达量分别为一次灿烂弧菌刺激（SW-VS）表达量的1.50倍（p<0.05）,1.68倍（p>0.05）和1.95倍（p<0.01）。4.长牡蛎CgTLR2信号对下游基因和炎症因子表达的调节利用siRNA干扰技术敲降CgTLR2的表达,检测灿烂弧菌刺激6 h后CgTLR2的表达变化,发现CgTLR2在i CgTLR2+VS组（实验组）的m RNA表达水平显著下降,是NC+VS组（对照组）的0.27倍（p<0.001）。同时,实验组中下游CgMyD88-2、CgMyD88s和Cg IL17-1的m RNA表达也显著下降,分别为对照组的0.32（p<0.001）倍、0.23倍（p<0.001）和0.26倍（p<0.001）。利用siRNA干扰技术敲降CgMyD88-2的表达,检测灿烂弧菌刺激6 h后CgMyD88-2的表达变化,发现CgMyD88-2在i CgMyD88-2+VS组（实验组）的m RNA表达水平显著下降,是NC+VS组（对照组）的0.20倍（p<0.001）。同时,实验组中下游CgMyD88s和Cg IL17-1的m RNA表达也显著下降,分别为对照组的0.32（p<0.001）倍和0.43倍（p<0.01）。用siRNA干扰技术敲降CgMyD88s的表达,检测灿烂弧菌刺激24 h后CgMyD88s的表达变化,发现CgMyD88s在i CgMyD88s+VS组（实验组）的m RNA表达水平显著下降,是NC+VS组（对照组）的0.37倍（p<0.001）。但是,实验组中下游CgMyD88-2和Cg IL17-1的m RNA表达显著上升,分别为对照组的3.98倍（p<0.01）倍和2.48倍（p<0.01）。综上所述,CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s的分子结构较为保守,CgTLR2的胞外段r CgTLR2-LRR可以识别多种PAMPs,胞内段r CgTLR2-TIR可以与CgMyD88-2和CgMyD88s发生相互作用,且与CgMyD88-2的结合能力较强。CgTLR2、CgMyD88-2和CgMyD88s在各种组织中呈组成型表达,在颗粒细胞中表达量最高,且均能响应灿烂弧菌免疫刺激。CgTLR2-CgMyD88-2信号在免疫应答早期被激活并促进Cg IL17-1的产生,但这一信号在免疫应答后期被CgMyD88s抑制,以避免Cg IL17-1的过度产生。研究结果初步阐明了TLR信号在长牡蛎免疫防御中对炎症因子的调节作用,为深入了解无脊椎动物的免疫防御机制提供了重要参考。