背景:食管癌是上消化道最常见的恶性肿瘤之一,被认为是一种极难治疗的癌症。Ⅰ-Ⅲ期的食管癌通常通过手术切除食管受影响的部分来进行治疗。然而大约一半的患者在晚期才能被发现,已经无法进行手术切除。治疗这些病人只能以提高生活质量和延长生存期为目标。虽然在过去的几十年里,许多癌症患者的生存数据都有了两位数的增长,但是食管癌患者的5年生存率仍然很低。很明显在新的抗癌药物问世之前,食管癌患者生存率显著提高的可能性非常低。为了开发新型分子靶向治疗药物,绝对需要确定与这种疾病的发生发展相关的分子事件和主要靶标。食管癌治疗中探索细胞外基质蛋白是一类非常具有吸引力的靶点。肿瘤细胞在细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的环境下发生并发展。ECM对胚胎和成年组织微环境的正常发育和维护至关重要。ECM由结构蛋白、粘多糖、生长因子和细胞因子、分泌酶和称作基质细胞蛋白的糖蛋白组成。ECM不仅为组织和器官提供了结构稳定性,而且通过将不活跃的前体形式直接连接成ECM的结构成分来调节生长因子和细胞因子的活动。ECM的合成对包括粘附、增殖、迁移以及维护干细胞的微环境等细胞的行为有深远的影响。此外,基质细胞蛋白还参与了动态基质-细胞间相互作用和细胞功能微调。Fibulin-5(FBLN-5)是细胞外基质蛋白的Fibulin家族中7个成员中的一个,也被称为EVEC或DANCE,在人染色体中位于14q32.1,属于二类短fibulins,于1999年由两个尝试分离一个新的血管生长调节剂的研究小组首次识别。它是一个典型的杆状形态为特点的小分泌糖蛋白,分子量为66 k Da,含448个氨基酸,由两种结构模块构成,即表皮生长因子样(epidermal growth factor-like,EGF-like)区域重复和一个独特的C端fibulin-type模块。在第一个钙结合的表皮生长因子样重复中有一个富含脯氨酸的插入序列,其通过结构域与大量的ECM和分泌蛋白相互作用。与其他的fibulins不同,FBLN-5包含一个整合素结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)基序。从功能上说,FBLN-5结合αvβ3、αvβ5和α9β1整合蛋白,通过其RGD基序来调节内皮细胞粘附。先前的研究已经表明,Fibulin-5在不同类型的癌症中具有肿瘤促进和肿瘤保护功能,但是其分子机制尚未探明。在本研究之前,尚无关于Fibulin-5在食管癌中相关作用的报道。因此,本研究中首先探讨了调查了Fibulin-5在人食管癌中的表达情况;然后通过体外和体内研究以验证食管上皮细胞中Fibulin-5的致癌特性;最后初步探讨了在食管上皮细胞内Fibulin-5具有致癌活性的分子机制。第一部分Fibulin-5蛋白在食管癌患者中表达情况的调查目的:探讨Fibulin-5在食管癌中的表达情况及其与临床指标之间的关系方法:收集经病理确诊的食管癌患者组织,包括100个食管癌组织和80个癌旁组织的组织芯片。采用免疫组织化学方法分析Fibulin-5在食管癌组织及癌旁组织中的表达状态。并且分析Fibulin-5在细胞质及细胞核中的表达与肿瘤细胞增殖标记物ki67的表达的关系,与包括年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级、T分期、淋巴结转移及临床分期等临床指标的关系。并分析Fibulin-5表达与临床不良预后因素和存活时间的关系。结果:与癌旁组织相比,癌组织中的Fibulin-5在细胞质和细胞核中均有较高的阳性染色信号,并且Fibulin-5细胞质的表达与肿瘤细胞增殖标记物ki67的表达呈正相关。临床指标相关性分析,发现细胞浆中Fibulin-5的表达水平与组织学分级,淋巴结分期和临床分期呈正相关,而核分级仅与淋巴结分期相关。生存分析显示具有较高Fibulin-5胞质表达的患者,其预后比较低Fibulin-5胞质表达的患者更差。结论:Fibulin-5在人食管癌组织高表达,其可能在食管癌中发挥肿瘤促进作用。第二部分Fibulin-5转化食管上皮细胞的研究目的:探讨Fibulin-5在食管上皮细胞中的致癌特性。方法:首先构建Fibulin-5哺乳细胞表达质粒,建立p MSCV-Fibulin-5-puro稳定转染的食管上皮HET-1A细胞系;然后使用软琼脂集落形成试验来检测其转化正常食管上皮HET-1A细胞的能力,4周后与转染pc DNA3.1的阴性对照和未转染任何质粒的HET-1A细胞中细胞集落比较;最后采用小鼠肿瘤异种移植模型来研究其致瘤潜力,向10只小鼠皮下注射了Fibulin-5过表达HET-1A细胞,4周后观察小鼠的肿瘤生长情况,并与注射正常HET-1A细胞的小鼠相比较。结果:正常食管上皮细胞转染p MSCV-Fibulin-5-puro和p MSCV-puro质粒,经嘌呤霉素筛选后,4周左右构建成稳定转染细胞系,Western Blotting检测发现,未转染和转染空白载体p MSCV-puro的细胞内无Fibulin-5表达信号,而Fibulin-5稳定转染细胞系有明显可见的免疫信号,证实Fibulin-5的过度表达;软琼脂集落形成试验观察到在接种4周后有Fibulin-5过表达的HET-1A细胞形成的许多细胞集落,但是转染pc DNA3.1的阴性对照和未转染任何质粒的HET-1A细胞均未形成细胞集落;10只皮下注射了Fibulin-5过表达HET-1A细胞的小鼠,4周后有9只生长出平均大小的肿瘤,而注射正常HET-1A细胞的小鼠中未见任何肿瘤。结论:Fibulin-5对食管上皮细胞有转化作用,其可能在食管癌发展中起驱动基因的作用。第三部分Fibulin-5原癌活性分子机制的探索目的:初步探讨在食管癌细胞内Fibulin-5具有致癌活性的分子机制。方法:首先构建fibulin-5基因敲除载体,建立PX330-FBLN5和对照PX330稳定转染的食管癌EC109细胞系,用Western Blotting检测AKT Ser473的磷酸化水。结果:4周左右成功构建成稳定转染fibulin-5基因敲除细胞系,Western Blotting检测发现,相比未转染和转染空白载体PX330的细胞,fibulin-5基因敲除细胞内Fibulin-5表达信号显著降低,证实fibulin-5的基因敲除成功;与正常培养的细胞相比,过度表达和降低表达Fibulin-5的细胞内AKT蛋白的表达水平无明显不同,相反,这3种细胞内AKT Ser473磷酸化水平则显著不同。结论:Fibulib-5可能通过激活AKT信号传导赋予其在食管癌的肿瘤促进功能。