论文部分内容阅读
目的:结直肠癌为常见的人恶性肿瘤之一。目前,结直肠癌的治疗方式主要根据癌症发生的部位、分期及癌症进展情况来选择。早期癌症主要依靠外科手术或辅以术前或术后放化疗,内分泌治疗等,但是,当癌症进入中晚期时,尤其发生严重转移后,则无法通过手术治疗达到预期效果。传统的治疗方法主要利用了化疗药物同时配合放射治疗来控制癌症的扩散和恶化。近些年来,基因的靶向治疗成为了肿瘤治疗新的热点,也为结直肠癌的治疗提供了许多新的方向,在多方面提高了结直肠癌患者的治愈率生存质量。在多年的研究中发现,结直肠癌最主要的转移部位是肝脏,在确诊为结直肠原发癌的六个月内,约有25%-30%的患者发生了肝转移。结直肠癌肝转移是一个非常复杂的生物学过程,其机制尚不十分明显,肝转移是结直肠癌发生和预后不良的主要原因。Micro RNA(mi RNA)作为一种内源的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,在细胞内具有多种非常重要的调节作用。Mi RNA突变与异位表达与多种人类癌症密切相关,mi RNA可以起到抑制肿瘤的发生发展或者促进肿瘤进展的作用,同时可以抑制或促进多种肿瘤相关基因表达。大量的研究表明,mi RNA在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用,其中包括影响肿瘤细胞增殖、凋亡和转移等恶性生物学行为。Micro RNA(mi RNA)作为一种非编码短链RNA,在转录后的水平调节了多个靶基因的表达,涉及了一系列的细胞发育过程调控。mi RNA成为了近年来生命科学研究热点,很多研究表明其与恶性肿瘤的发生有密切关系。Micro RNA-196a-5p(mi R-196a-5p)被报道参与在一些癌症的转移过程中,mi RNA-196a近期被发现是与乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤的发生发展密切相关的生物靶分子。然而,mi R-196a-5p结直肠癌肝转移的作用机制尚未见明确报道。NF-κB蛋白是与靶基因结合来调节其表达的转录因子。最近有研究报道了NF-κB途径的激活与不同类型癌症的转移相关。一项研究表明,STX2与NF-κB形成一个正向信号回路。此外,也阐明NF-κB信号通路失活抑制了结直肠癌细胞的侵袭,转移和EMT。在本研究中,我们探讨mi R-196a-5p及其潜在靶点IκBα对结直肠癌细胞(CRC)迁移,侵袭和上皮-间质转化(EMT)的影响。Mi R-196b-5p参与在多种癌症中的表达。在结直肠癌中,mi R-196b-5p也被证实了起到了促癌基因的作用。ING(正目的生长抑制基因)包括5个家族成员,其中,ING5定位在人染色体的2q37.3位置,其含有8个外显子和7个内含子,从氨基到羧基末端的ING5蛋白含有亮氨酸拉链样、新保守区、核定位序列和植物同源结构域。其不同区域行使了不同的功能。有很多研究发现,恶性肿瘤发生发展的过程中存在ING蛋白表达水平的下调或者缺失,癌细胞中ING的表达参与了细胞凋亡的调节。一些体内外实验也发现ING蛋白调节细胞凋亡的作用但是其与下游基因ING5的抑制作用并未见明确报道。本研究旨在探究mi R-196b-5p与ING5结合抑制结直肠癌细胞中的恶性生物学行为。本研究首先明确mi R-196a-5p、mi R-196b-5p在直肠癌细胞中的内源性表达,进一步研究mi R-196a-5p是否通过靶向结合IκBα在结直肠癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)过程中发挥重要作用;mi R-196b-5p是否与ING5结合对抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进结直肠癌细胞凋亡等恶性生物学行为发挥重要作用。研究将提供mi R-196a-5p、mi R-196b-5p在结直肠癌中的新的作用机制,并为其治疗提供新思路。研究方法:1.结直肠癌细胞SW480,SW620,HCT116,Caco-2和Lo Vo和人胚肾细胞HEK293T的培养。2.双荧光素酶报告基因实验。3.Real-time PCR方法检测mi R-196a-5p、mi R-196b-5p、ING5等在结直肠癌组织和结直肠癌细胞中的表达。4.CCK8法检测细胞增殖。5.免疫组织化学法检测mi R-196a-5p的分布。6.免疫荧光实验方法检测蛋白表达和分布。7.Transwell实验方法检测细胞的迁移和侵袭。8.细胞划痕实验方法检测细胞的迁移能力。9.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期。10.Western blot实验方法检测蛋白表达的。11.裸鼠移植瘤模型观察瘤体生长的变化和裸鼠生存时间的变化。结果:1.Mi R-196a-5p在结直肠癌细胞SW480,SW620,HCT116,Caco-2和Lo Vo细胞中表达上调。2.Mi R-196a-5p促进结直肠癌细胞的增殖。3.Mi R-196a-5p促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。4.Mi R-196a-5p促进结直肠癌肝转移。5.Mi R-196a-5p促进结直肠癌细胞的EMT。6.通过抑制NF-κB信号通路从而抑制结直肠癌细胞的EMT。7.Mi R-196a-5p通过与IκBα的靶向结合促进了结直肠癌细胞的EMT和结直肠癌细胞的迁移和侵袭。8.Mi R-196b-5p在结直肠癌细胞(SW480和HCT116)中高表达。9.Mi R-196b-5p促进结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭,抑制细胞凋亡。10.ING5抑制结直肠癌细胞的增殖迁移和侵袭,促进结直肠癌细胞的凋亡。11.ING5是mi R-196b-5p的靶基因,mi R-196b-5p抑制ING5的表达。12.ING5敲低抑制mi R-196b-5p在结直肠癌细胞中的表达,抑制结直肠癌细胞增殖迁移和侵袭,并且促进细胞凋亡。13.Mi R-196b-5p在体内移植瘤模型中发挥促进肿瘤生长的作用。结论:1.Mi R-196a-5p在结直肠癌细胞SW480,SW620,HCT116,Caco-2和Lo Vo中高表达。2.Mi R-196a-5p促进直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT和肝转移。3.IκBα是mi R-196a-5p的靶基因。4.Mi R-196a-5p通过与IκBα的m RNA的3’UTR靶向结合,促进结直肠癌细胞迁移、侵袭和EMT。5.Mi R-196b-5p在结直肠癌细胞(SW480和HCT116)中高表达,ING5低表达。6.Mi R-196b-5p能够促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并且抑制细胞凋亡。7.ING5能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。8.ING5是mi R-196b-5p的靶基因,mi R-196b-5p通过靶向结合ING5的m RNA的3’UTR促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡。9.双敲低mi R-196b-5p和ING5促进结直肠癌细胞(SW480和HCT116)的增殖、迁移和侵袭,并在体内移植瘤模型显著促进肿瘤的生长。