论文部分内容阅读
利用bar作为筛选标记基因,cecropinB为非筛选基因,基因枪法介导将不含质粒载体主干序列的bar和cecropinB表达框(包括启动子、基因开放阅读框和终止子)以及携带bar和cecropinB基因的质粒pCB1和pCB4导入了两个粳稻品种秀水04和嘉59。研究了基因枪介导外源基因表达框转化水稻的影响因素,比较研究了外源基因表达框和完整质粒在水稻基因组中的整合特征和遗传表达规律,并分析了外源基因在杂交转育中的遗传和表达行为。结果表明: 1 基因枪介导外源基因表达框转化水稻的频率约在0.1~0.5%之间,非选择标记基因的共转化频率约为50~60%;非选择标记基因cecropinB表达框在水稻基因组内整合模式简单,仅有1~3个拷贝:筛选标记基因bar表达框却比完整质粒转化后的整合模式复杂,插入拷贝数在4~14个之间。 2 基因枪介导转化线性bar基因表达框DNA在水稻基因组内整合时易发生重组和截断。bar基因表达框在水稻基因组内存在头接头、头接尾、和尾接尾三种重组串联方式,多个拷贝的bar基因表达框DNA通过重组连接形成了1~3个转基因串联子整合在水稻基因组内的一个较大的相互临近染色体区域。含DNA重组热点相似序列的CaMV35S启动子可能是bar基因重组的重要原因。 3 多拷贝bar基因表达框之间的遗传分离和表达互作使得转基因水稻株系的Basta抗性分离行为比含bar基因质粒转化的株系复杂,但基因表达框转化时约30%的(3株纯合/10个株系)株系在T1代就能得到纯合体。 4 相互独立的bar和cecropinB基因表达框共转化的水稻株系中,50%以上(4/7)的株系在T1代筛选标记基因和非筛选基因连锁遗传的频率较低。Basta抗性易于检测,因此标记基因bar剔除极为方便,利用遗传分离策略,在转基因植株T1代对Basta敏感植株PCR筛选,获得2株无bar标记基因的cecropinB基因表达框转化植株,这两个植株除cecropinB基因表达框外不含任何垃圾DNA,是真正安全的转基因植株。因此,基因枪介导基因表达框共转化后应用遗传分离策略剔除标记基因,为培育安全转基因植株开创了有效新途径,是本研究的创新点之一。 5 cecropinB基因的表达水平受位置效应的影响较大,与转化时采用质粒或表达框形式、Actin或rbcS启动子驱动以及植株是四倍体或二倍体之间并无直接对应的关系,cecroplnB基因的mRNA转录水平和转基因植株的抗白叶枯病能力之间也不存在显著的对应关系。 6单拷贝外源bar基因在秀水04四倍体突变株系X工P一1中的遗传行为比较复杂,但主要符合巧:1分离。在四倍体株系后代中,b二和cecr口pl万B基因的Southern整合模式出现了与T。代完全不同的新杂交带,可能是四倍体植株减数分裂过程中转基因所在位点的染色体结构发生断裂重组造成的。这是首次报道外源基因在水稻四倍体变异株中的遗传行为,是本研究的创新点之二。 7在bar基因表达框转化的植株中存在可遗传的发芽率降低和白化苗突变性状,这些性状变异可能主要由组织培养引起。8基因枪介导高世代群体分析,和表达。pCBI质粒转化获得的京引119转基因株,通过连续世代跟踪和表明bar和cec厂口户了褚基因在自交高世代(T0订6)能稳定遗传 9在杂交转育中,水稻基因组中的外源非筛选基因cecroPll7B的Southern整合模式十分稳定,筛选标记基因加r却与转基因供体不完全相同。筛选标记基因bar在连续筛选压下,能随着杂交传递稳定表达,非筛选基因cecroP了昭表达行为因转基因供体的不同表现出较大差异。转基因供体中表达的cecroPjnB基因在杂交植株后代中可能发生沉默,转基因供体中沉默的cecr口户1’nB基因经杂交转移后也可能活化表达。自交高世代稳定表达的京引119转基因株为供体的杂交群体中,bar和cec厂口刀了nB基因也能稳定表达。这是首次系统研究基因枪介导转化的外源基因基因在杂交转育中的整合模式的遗传和表达行为,是本研究的创新点之乡