木聚糖酶作为自然界中天然存在的酶类,分布范围很广,在海洋微生物、陆地微生物、以及草食性动物的胃中都有发现,它的主要作用是降解自然界中储量丰富的半纤维素,可在饲料制作、食品加工、生物能源制造以及造纸漂白工业中广泛应用。将G/11家族木聚糖酶加入到造纸漂白工艺中,可显著降低造纸漂白工艺对氯离子的依赖,这是因为其具有较小的酶分子量且只能特异性降解影响纸浆白度的半纤维素的原因。造纸工业因为工艺的要求,需要在高温高pH值下进行纸浆漂白,所以要求在纸浆中加入助漂的木聚糖酶必须有在温度高、碱性高的条件下保持相对稳定活性的性质。现阶段,利用基因重组和蛋白质改造手段有目的的使木聚糖酶提高特性成功的报道很多,但对其耐碱性的成功提高鲜有报道。这是因为木聚糖酶种类不同,其耐碱机制有显著差异。虽然都为同家族糖苷水解酶,但因其在长期进化中出现的对碱性环境的适应策略不同,也使其产生了各不相同的耐碱机理。目前,对G/11家族木聚糖酶耐碱性的研究还在深入进行,统一适用于全家族木聚糖酶的机制还没有被发现。本实验通过易错PCR法和双酶切载体重构建法建立了目的基因随机突变文库,其总共包含11063个单克隆。经两轮筛选,从中筛选到了D89R、E109R、E135R和E160R四个突变体,其在pH8.0-9.5范围内相对酶活性均比出发菌株酶高15%左右。其中E135位点在pH9.0时其相对酶活力比出发菌株酶高出20%,对其进行氨基酸的定点突变后发现E135A、E135M、E135T、E135Y、E135H、E135Q突变酶的最适作用pH值为8.0,E135P突变酶的最适作用pH为6.0。其余突变酶的最适作用pH与出发菌株酶一致。在此基础上,我们又将四个突变位点进行了组合突变,各个组合突变体酶与底物的亲和力和催化效率都比野生型出发菌株酶高,最适作用温度与野生型酶保持一致,而pH稳定性也明显优于野生型酶,能够在pH4.5-10.5保持稳定,四位点突变酶的最适作用pH值为8.5,比出发菌株酶高出一个pH单位,三位点突变酶的最适作用pH值为8.0,比野生型高出0.5个pH单位。初步分析,推测其耐碱性提升与分布在酶分子表面的带负电荷氨基酸残基被突变为带正电荷氨基酸残基有关。通过蛋白质结构三维模拟后发现,突变后的E135R位点可能与D89R形成一个精氨酸胍基,使酶分子结构发生改变,进而使突变酶的耐碱性提升。本实验为改造G/11家族木聚糖酶Xyn11A-LC耐碱性提供了一种可行的方法,也为木聚糖酶耐碱性的研究提供了一定的帮助。