背景近30年来，吸入麻醉药因其同时兼具全麻效应，对心、脑、肾等重要脏器的缺血损伤的保护作用及可能的神经毒性，而成为麻醉领域的研究热点之一，也引起了临床的广泛关注。为什么一种药物会产生如此复杂的效应呢？其机制又是什么呢？目前尚不完全清楚。已有大量分子、细胞水平的离体和在体研究提示许多离子通道、离子通道型受体、经典神经递质等可能是全麻中枢分子靶点。但它们是如何介导和终止其麻醉效应的，即其胞内信号转导分子及调控环节，尚知之甚少。关于吸入麻醉药的神经毒性问题，目前证据也主要来源于动物实验研究，其机制亦仅限于少量关于细胞凋亡方面的实验研究。钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是脑内含量最丰富的蛋白激酶之一。CaMKⅡ能调节神经元突触的许多功能，如神经递质释放、离子通道生理学和钙离子的动态平衡。在控制神经元的突触强度和可塑性方面发挥重要的作用，与学习和记忆的形成等密切相关。显然，CaMKⅡ的这些功能都与麻醉和睡眠觉醒密切相关，但是否参与麻醉效应的调控尚无直接证据。新近研究表明，CaMKⅡ在心脏缺血保护、Glutamate/GABA介导的脑缺血损伤保护及神经退行性病变中具有重要作用，使其成为相关领域新的药物靶点之一。近年来，我们研究发现，吸入麻醉-苏醒过程中全麻敏感脑区内CaMKⅡ等多种蛋白激酶分子发生显著可逆性的磷酸化改变。这种现象引起了我们浓厚的兴趣，结合已有研究我们推测，CaMKⅡ磷酸化可能参与吸入麻醉药全麻效应及可能的神经毒性作用的调控。因此，本研究拟探讨CaMKⅡ磷酸化对异氟烷全麻效应及神经毒性的影响，以进一步探索吸入麻醉药全麻效应及神经毒性机制，为吸入麻醉药的临床安全合理应用提供科学的依据。实验一CaMKⅡ磷酸化对大鼠异氟烷全麻效应的影响目的探讨CaMKⅡ磷酸化在异氟烷吸入全身麻醉中的作用。方法采用经侧脑室置管全脑给药，将SD大鼠随机分为溶剂对照组(control组)、CaMKⅡ抑制剂钙调蛋白自变性抑制肽(myrAIP1,5,10uM)处理组(n=10)和CaMKⅡ激动剂钙调素(CaM1.25,5,10ug)处理组(n=10)，给药40min后行异氟烷吸入麻醉(1MAC，30min),观察给药后动物的行为反应变化，记录大鼠异氟烷麻醉及清醒时翻正反射(LORR)消失及恢复时间，并于异氟烷麻醉30min取脑组织样本进行pCaMKⅡα蛋白定量分析。结果给予CaMKⅡ抑制剂组的动物LORR恢复时间有明显延长(P<0.05)，激动剂组动物LORR消失及恢复时间有明显缩短(P<0.05)；与对照组相比，抑制剂组全脑内pCaMKⅡα蛋白表达量在给药40min时间点和异氟烷麻醉30min时间点均明显降低(P<0.05)，皮层内pCaMKⅡα蛋白表达量在异氟烷麻醉30min时间点明显下降(P<0.05)。结论异氟烷麻醉-苏醒过程中大鼠脑内CaMKⅡ磷酸化水平呈可逆性抑制改变，调控脑内CaMKⅡ磷酸化水平可部分改变异氟烷麻醉-苏醒的过程。实验二异氟烷暴露对原代培养大鼠神经元的神经毒性作用研究目的探讨异氟烷暴露对原代培养大鼠脑皮质神经元细胞的毒性作用。方法选用怀孕16-18天的孕鼠，取其胎鼠皮层神经元进行体外培养，取培养7～10天的神经元进行实验。随机分为四组(n=10)：溶剂对照组(CON)、异氟烷溶液0.32mM处理组(0.32)、0.64mM处理组(0.64)和0.96mM处理组(0.96)。各组均处理6h，检测各组细胞活力MTT和乳酸脱氢酶的释放LDH，并进行TUNEL凋亡细胞染色和计数。结果与对照组相比，三种浓度异氟烷处理组的MTT值均显著降低(P<0.05)，LDH释放百分比则明显升高(P<0.05)，TUNEL阳性细胞亦明显增多(P<0.05)，但不同剂量组之间均无差异(P>0.05)。结论异氟烷暴露可诱导胎鼠原代培养神经元凋亡增加而产生神经毒性效应。实验三CaMKⅡ磷酸化在异氟烷神经毒性中作用的体外实验研究目的探讨CaMKⅡ磷酸化在异氟烷神经毒性中的作用。方法选取0.64mM异氟烷处理培养7～10天后的神经细胞6h，异氟烷处理前提前两天在培养基中加入CaMKⅡ抑制剂十四烷酰肉豆蔻酰-钙调蛋白自变性抑制肽(myrAIP)或激动剂钙调素(CaM),抑制剂实验将细胞随机分为对照组、异氟烷处理组、异氟烷加CaMKⅡ抑制剂组(浓度为1μM、5μM、10μM)(n=10)，激动剂实验分为对照组、异氟烷处理组、异氟烷加CaMKⅡ激动剂组(浓度为1.25μg、5μg、10μg)(n=10)。检测细胞活力MTT和乳酸脱氢酶的释放LDH，对细胞进行TUNEL荧光染色观察凋亡细胞并计数。结果抑制剂实验中，与对照组相比，各处理组MTT值明显降低、LDH释放明显增高(P<0.05)，凋亡神经元明显增多(P<0.05)，异氟烷加抑制剂组的凋亡细胞明显多于单纯异氟烷处理组(P<0.05)；激动剂实验中，异氟烷加激动剂组部分逆转了单纯异氟烷处理引起的MTT下降和LDH增高(P<0.05)并减轻了单纯异氟烷处理引起的凋亡细胞增多(P<0.05)。结论CaMKⅡ抑制剂能明显加重异氟烷的神经毒性，CaMKⅡ激动剂部分逆转了了异氟烷的神经毒性；抑制CaMKⅡ磷酸化导致凋亡增加可能是异氟烷神经毒性的机制之一。小结1.CaMKⅡ磷酸化水平的改变可在一定程度上对全身麻醉及苏醒的进程产生影响，提示CaMKⅡ的磷酸化可能参与了异氟烷产生全身麻醉的作用机制。2.异氟烷暴露可对原代培养的胎鼠皮质神经元产生神经毒性作用。3.抑制CaMKⅡ磷酸化水平能够明显加重异氟烷的神经毒性作用，而提高CaMKⅡ磷酸化水平则可减轻异氟烷神经毒性，分别表现为凋亡细胞的增加和减少，提示异氟烷可能通过CaMKⅡ对凋亡的调控而介导其神经毒性作用。