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大豆是全球重要的粮食作物和油料作物,尤其是大豆油消费占全球植物油脂市场的29.18%,且需求量持续增加。解析大豆种子油脂生物合成及调控机制可为大豆油脂产量和品质的遗传改良提供理论指导和关键修饰靶标。硬脂酰-ACPΔ~9脱氢酶（stearoyl-acyl carrier proteinΔ~9desaturase,SAD）是决定植物细胞组织饱和与不饱和脂肪酸合成比例的关键酶,催化饱和的硬脂酰-ACP（C18:0）或棕榈酰-ACP（C16:0）在脂肪酸链的C9-C10间产生第一个双键,从而形成单不饱和的油酰-ACP（C18:1）和棕榈油酰-ACP（C16:1）。大豆SAD有几个家族成员,各成员的底物选择性是怎样的,各成员对大豆种子油脂生物合成积累贡献是否有差异,以及大豆SAD成员参与的其他生理生命过程,迄今还未见有关这些科学问题详尽报道。为此,本文全基因组鉴定大豆SAD家族成员,分析其蛋白结构及理化特征,定量检测大豆SAD各成员的时空表达谱,获得高表达基因c DNA克隆,并通过在INVSc1野生型酵母过表达、酵母突变体BY4389超表达和在烟草叶组织瞬时表达测试系统鉴定大豆SAD各成员的生物学功能,此外,探究了大豆SAD在冷胁迫下的响应。主要研究内容及结果如下:1.以拟南芥SAD（AtSADs）蛋白序列作为检索序列BLAST大豆基因组数据库,共鉴定获得5个大豆SAD家族成员,用生物信息学工具对各成员的基因结构和蛋白的性质、结构、保守程度等进行初步预测分析。结果发现这些酶均以同型二聚体形式存在,且含一个属于类铁蛋白家族和属于酰基-ACP脱氢酶家族的保守结构域。这5个大豆GmSADs基因的内含子数目差异较大,GmSADs编码蛋白长度、相对分子量、理论等电点等理化性质也随其基因编码序列的长短和碱基比例不同而表现出不同的差异。多序列比对和系统发育分析均表明大豆SAD家族成员具有较高的保守性。2.对GmSADs在大豆品种Jack的根、茎、叶、花、果荚和种子三个时期的表达进行探究。结果表明,大豆GmSADs成员在大豆不同组织和不同发育时期种子中的表达模式不同。在各组织中均检测到GmSAD1和GmSAD2较高的转录水平,GmSAD3和GmSAD4在上述检测的组织中不表达,而GmSAD5在种子中极高量表达,并随着种子的成熟表达量逐渐升高,这与种子油脂积累模式相吻合,表明不同成员在进化上有功能差异性,GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5参与大豆种子的生长发育,其中GmSAD5在发育种子中特异表达。3.克隆GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5基因,并通过农杆菌将GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5基因在烟草叶片中异源表达分析其功能。将构建的植物表达载体pCAMBIA1303-GmSAD1、pCAMBIA1303-GmSAD2和p CAMBIA1303-GmSAD5分别转到农杆菌菌株GV3101中,通过注射法使农杆菌侵染本氏烟草叶片,PCR验证GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5三个目的基因在烟草叶片中均有效表达,瞬时表达烟草叶片的脂肪酸谱和总脂含量分析表明,GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5能将饱和脂肪酸脱氢转化为不饱和脂肪酸,具有SAD功能,偏好于催化C18:0-ACP生成C18:1-ACP,且促进总油脂的积累。4.构建相应酵母表达载体,在INVSc1酿酒酵母中进行过表达验证,在缺陷型BY4389酿酒酵母中进行功能互补验证。将每个重组酵母表达载体p YES2.0-GmSAD1、p YES2.0-GmSAD2和p YES2.0-GmSAD5分别在INVSc1酵母和缺陷型BY4389酵母中表达,并分别分析转基因INVSc1酵母和转基因缺陷型BY4389酵母的脂肪酸组分和含量及总脂含量。结果表明GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5均具有SAD酶活性,主要以硬脂酰-ACP（C18:0-ACP）为底物催化其脱氢形成油酰-ACP（C18:1-ACP）,且其在酵母中的表达能增加转基因酵母的总脂含量。5.对大豆幼苗进行冷胁迫,分析大豆GmSADs在该条件下的表达及调节,从而鉴定出大豆SAD各成员在冷胁迫条件下的新功能。大豆幼苗在4℃条件下分别冷胁迫0、4、8、12、24 h,检测GmSADs的表达和不饱和脂肪酸的含量变化,结果显示,在4℃冷胁迫条件下,大豆GmSADs中只检测到GmSAD1和GmSAD2的表达,GmSAD1的表达随冷处理时间的延长呈上升趋势,GmSAD2的表达则不稳定。随着冷胁迫时间的延长,幼苗的不饱和脂肪酸含量呈现先升高后下降的趋势,在8 h的含量最高,但处理组与对照相比,不饱和脂肪酸的含量均要高于对照组。总的来说,不同GmSADs成员有不同的功能特性,仅GmSAD1和GmSAD2参与大豆幼苗在低温胁迫下的调节,且冷胁迫条件下,植物中的不饱和脂肪酸含量均相应上升。