一、原代大鼠海马神经元培养、鉴定及形态学观察目的：通过对新生24h内SD大鼠海马神经元培养，掌握大鼠海马神经元体外培养方法；利用免疫荧光细胞化学鉴定神经元纯度；观察原代海马神经元形态学特点，测定细胞生长曲线。方法：取新生24h内SD乳鼠，断头取脑，于预冷D-hanks玻璃皿中，剥离两侧海马，剥除血管、被膜，用眼科虹膜剪将海马组织剪成小块，将其移入离心管，以800r/min5min离心弃上清，加入3倍于海马组织体积的Accutase酶，放入培养箱消化10~20min，含10%FBS的DMEM洗涤组织块3次终止消化，经200目铜滤网过滤。收集过滤后的细胞以800r/min5min离心，弃上清，加入含10%FBS的DMEM液，吹打成细胞悬液。转至塑料培养瓶中，放入培养箱经差速贴壁1h，收获贴壁速度较胶质细胞慢的神经元，吹打后以0.4%台盼蓝染色计数活细胞并调整悬液的细胞密度，按1×106/mL的浓度将细胞种植在Matrigel基膜包被后的盖玻片上，置于37℃，5%CO2培养箱内。24h内全量换含有1%N2、2%B27的Neurobasal培养液，其后，每两天半量换液，并在倒置相差显微镜下观察神经元生长情况。取培养7d神经元，固定，0.3%的Triton作用15~20min，10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)37℃孵育30min封闭非特异性结合位点。2%BSA稀释的小鼠抗大鼠β-tublinШ单克隆抗体(1：200)4℃过夜，加入2%BSA稀释的1:50FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗、50μg/mL Hoechst33258复染细胞核，湿盒内室温避光孵育1h，倒置荧光显微镜下观察,以β-tublinШ单克隆抗体荧光染色显示海马神经元，用Hoechst33258复染显示所有细胞核。神经元纯度计算方法：在高倍显微镜下随机选取5个视野，计算阳性神经元的纯度。将细胞接种于96孔板，每隔两天测吸光度值，共测5次得出生长曲线。结果：1原代培养的海马神经元，刚接种的细胞呈圆形，体积小、透亮、呈悬浮状态，单个均匀分布，培养3h后开始贴壁，接种20h后可见大部分细胞已贴壁，细胞形态多呈梭形、三角形，长出细长突起，长短不一。3d后细胞具有典型神经元的形态特征，胞体饱满，多呈梭形，胞浆丰富，细胞聚集成团，突起较前明显增长、增粗，连接成网络。7~10d神经元胞体最丰满，周围光晕明显，突起交织成更加稠密的网络，突起增粗增长且光晕明显，立体感增强。20d后神经细胞开始退化，细胞边缘光晕变淡，突起开始退缩，部分细胞核固缩明显。2原代培养海马神经元，经神经元特异性标记物β-tublinШ单克隆抗体和Hoechst33258荧光染色后在荧光倒置显微镜下鉴定，计算海马神经元纯度为94.2%±3.6%，能够满足进一步的实验要求。3原代海马神经元生长曲线测定显示，海马神经元体外培养条件下经历了生长潜伏期(2~4d)，对数生长期(4~14d)，后进入生长平台期(14~16d)，细胞生长处于停滞状态。结论：1原代SD乳鼠海马神经元，培养10d后细胞形态趋于成熟。相差显微镜下形态呈锥体形、梭形、三角形。2原代培养海马神经元免疫荧光细胞化学染色为β-tublinШ阳性细胞，纯度为94.2%±3.6%。3原代海马神经元培养经历一个生长潜伏期，对数生长期，平台期。二、氯胺酮对原代培养海马神经元的神经毒性作用及机制探讨目的：观察不同浓度氯胺酮作用不同时间对发育期海马神经元形态学改变和细胞活力的影响，探讨氯胺酮对海马神经元的损伤作用。通过MTT、Hoechst33258荧光染色观察NMDA是否能够减轻氯胺酮的神经毒性,并利用免疫组化及Western blot方法观察cPKCγ-GAP-43信号通路在氯胺酮神经毒性中的作用。方法：取原代培养4-5d海马神经元，加入0.1uM、1uM、100uM、300uM、1mM不同浓度氯胺酮，分别作用3、6、12、24h后，测量MTT值。每次实验设空白对照组，即原代培养基。细胞活力=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)。根据MTT结果进一步实验，分为正常对照组和氯胺酮处理组。氯胺酮处理组采用首次实验的各浓度。实验各组培养12h后在倒置相差显微镜下观察各组神经元的最长神经突起(LPD)，分枝数目(PDs)及神经突起总长度(TDL)并拍照。经Hoechst33258荧光染色，荧光显微镜下观察各组神经元凋亡改变并拍照。根据形态学观察及Hoechst33258免疫荧光染色实验结果，进一步分为对照组、300uM氯胺酮处理组、100uM NMDA组及300uM氯胺酮与100uM NMDA混合组(K+N)，并分别标记为C、K、N及K+N组。利用MTT、Hoechst33258免疫荧光、免疫组化及Western blot分析各实验组cPKCγ、GAP-43及p-GAP-43蛋白表达量的改变。结果：1氯胺酮对海马神经元活力的抑制具有时间和浓度的交互作用(F=6.227, P<0.01)。在不同作用时间下，氯胺酮对神经元活力的影响具有显著差异(F=6.750, P<0.01),其中300uM和1mM氯胺酮在处理不同时间后差异具有显著性(F=4.192, P<0.05和F=44.444, P<0.01)，余各浓度处理不同时间后无显著性差异。当作用时间相同时，不同浓度的氯胺酮对海马神经元细胞活力的影响具有显著性差异(F=136.068, P<0.01),与对照组相比300uM和1mM氯胺酮在各个作用时间上均具有显著性差异，以1mM处理24h对海马神经元活力抑制最高，达40%。0.1和1uM氯胺酮分别在24h和12h增加了海马神经元活力(P<0.05)。2在作用时间为12h时，0.1uM及1uM组的TDL和LPD都较对照组显著增加(P<0.01)，但PDs只有1uM组较对照组显著增加(P<0.01)。随着氯胺酮浓度增加，细胞形态受到的抑制作用越明显，以300uM和1mM最显著(P<0.001)。1mM组PDs显著下降，由4.66±0.59下降至1.82±0.53(P<0.01)。3各浓度的氯胺酮经Hoechst33258显色示：对照组的神经元细胞核呈均匀蓝色光。0.1~10uM组细胞凋亡不明显，100uM、300uM和1mM组可见凋亡细胞，以300uM和1mM组明显。4作用时间为12h时，与C组相较，N组可显著提高神经元活力(P<0.05)，在K组混合加入100uM NMDA可显著改善氯胺酮对细胞活力的抑制作用(P<0.05)。经Hoechst33258显色，N组和K+N组细胞凋亡不明显，K组可见凋亡细胞。5免疫组化分析示，与C组相比，加入300μM氯胺酮可显著降低cPKCγ、GAP-43及p-GAP-43蛋白的表达量(P<0.01)，而加入NMDA后可显著改善氯胺酮对cPKCγ(P<0.01)、GAP-43(P<0.01)及p-GAP-43(P<0.05)蛋白的表达的抑制，但与C组相较仍存在显著差异。N组的蛋白表达量与对照组相较无明显差异。6Western blot分析示：N组在cPKCγ、GAP-43及p-GAP-43表达上与C组相比没有显著差异(P>0.05)，而加入300uM氯胺酮后可显著降低上述三种蛋白的表达量(P<0.01)，将氯胺酮混合加入NMDA后其cPKCγ、GAP-43及p-GAP-43的表达量较单纯加入氯胺酮组有显著增加。结论：1氯胺酮对海马神经元活力的抑制具有浓度及时间依赖性，在一定范围内神经损伤作用表现为细胞凋亡，随着浓度的增加及作用时间延长，氯胺酮对神经元毒性作用逐渐增强，以1mM最明显。2低浓度氯胺酮(0.1um及1uM)可促进原代培养海马神经元的生长。3氯胺酮可降低海马神经元cPKCγ、GAP-43及p-GAP-43蛋白的表达量。4加入100uM NMDA可显著改善氯胺酮对发育期海马神经元神经毒性作用。