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马铃薯卷叶病毒是马铃薯上最重要的病毒病之一,严重地威胁着马铃薯的生产。根据已有的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(Potato leaf roll virus coat protein,PLRV CP)基因序列(627bp)设计合成了一对特异性引物,用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法和酶联免疫吸附反应Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)的方法检测到了马铃薯卷叶病毒。以带毒植物总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链式反应扩增得到长0.62kb的目的片段,通过克隆载体pGEM-T将目的片段转入大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株上,构建了PLRV CP基因的克隆载体,并进行了测序。已经将测序所得到的序列登陆了NCBI(GenBank登录号为AY079210)。将序列测定结果与其他PLRV分离物CP基因序列进行比较,发现核苷酸同源性可达96%以上,氨基酸序列同源性可达97%左右,证明成功地得到了PLRV CP基因。对PLRV CP氨基酸序列与其不同分离物间进行的分子差异分析表明,PLRV不同分离物间CP氨基酸序列差异不太明显,同源性在96%-98%之间。依据PLRV CP氨基酸序列同源性建立了PLRV系统进化树并对PLRV不同分离物进行了类型分析。 双酶切克隆载体的重组质粒pRCP并回收目的片段,将所得目的片段连接到表达载体PGEX-2T上。通过热激法将该表达载体转化入大肠杆菌。构建了PLRV CP基因的表达载体,摸索了一些PLRV CP基因的不能够表达的条件。 利用合成的PLRV病毒特异性引物建立了PLRV的常规RT-PCR检测技术和核酸斑点杂交技术(Nucleic acid spot hybridization,NASH),并以NASH为重点,改进了NASH的检测技术。与原来的检测方法相比,改进后的方法更为实用:不但大大地缩短了检测所需要的时间,而且改进后检测方法的灵敏度也与常规方法的灵敏度基本相同。