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东亚砂藓(Racomitrium japonicum)能生长于裸露岩石、岩石薄土或石壁上,生命力极强,为典型的旱生藓类,植物体内必然存在着一系列应答逆境胁迫的高效、主效功能基因。同时,东亚砂藓发育模式简单,单倍体的配子体占生活史的主导地位,作为试验材料在分子水平上研究其耐旱性具有其他高等植物所没有的优势,是研究藓类植物耐旱特征的理想材料,在耐旱机理方面的研究具有重要意义。 本研究通过组织培养技术成功建立了东亚砂藓配子体的再生体系,为后续试验提供了纯净、均一化的材料。为探索东亚砂藓的耐旱机理,本研究采用生理学和分子生物学中转录组学(RNA-Seq)的试验方法,以东亚砂藓组培苗为试验材料,对东亚砂藓抗脱水胁迫的应答机制进行了研究。主要结果如下: (1)东亚砂藓最佳消毒方法为:将其在流水下冲洗2~3 h,再用浓度为0.02%的升汞消毒45~60 s,无菌水冲洗7~8遍。 (2) MS1培养基是原丝体初期生长的最适培养基。培养基中不同激素及其不同浓度对原丝体的扩繁生长有一定影响。6-BA浓度为1.5 mg/L时原丝体分化出芽体;2,4-D促使原丝体进行营养生殖,不分化芽体,当浓度为1.0 mg/L时原丝体团直径最大,扩繁情况最好,可作为原丝体扩繁培养基。而不添加任何激素和蔗糖的改良Beneck培养基在短时间内就能诱导出较长较粗壮的配子体,是诱导原丝体产生配子体的最佳培养基。 (3)研究发现,在脱水胁迫下,丙二醛和电解质外渗率整体呈现升高趋势,这说明东亚砂藓膜结构受到损害,而脯氨酸和可溶性糖的大量积累有利于保护膜结构的完整性。抗氧化酶系统的变化能提高东亚砂藓对氧化胁迫的防御能力。叶绿素荧光动力学参数的改变说明,东亚砂藓在对脱水胁迫作出响应时,会降低自身光合活性,从一定程度上缓解脱水胁迫对植物体造成的破坏。 (4)对东亚砂藓进行RNA-Seq大规模转录组测序,组装获得83552个基因,与不同数据库比对发现,匹配到Nr库的Unigene为51072条;匹配到Nt库的Unigene为28154条;匹配到COG库的Unigene为31027条,涉及25类功能;匹配到GO库的Unigene为21049条,分为41个功能群;匹配到Swiss-Prot库的Unigene为32696条;匹配到KEGG库的Unigene为35017条,涉及125个Pathway,参与到代谢途径、次生代谢产物的生物合成等途径中。获得显著差异表达Unigene41763条,其中33559条序列表达量上调,8204条序列表达量下调。结合生理指标的变化,鉴定出与脱水耐性相关的离子转运和重建离子平衡,渗透保护物质生物合成,植物激素及信号转导,活性氧清除及抗胁迫相关蛋白,转录因子,糖代谢,保护和修复光合系统,蛋白质合成与降解8类基因。对这些胁迫应答的关键基因进行系统的分析,更有助于深入了解东亚砂藓的耐旱机制。并对参与信号转导的RjRop、参与糖代谢的RjGAPDH和转录因子相关的RjbZIP基因进行了脱水和复水表达模式的分析,发现它们在东亚砂藓在抗脱水胁迫时发挥重要作用。 本研究提供了东亚砂藓在脱水胁迫下生理和转录组的有效数据,为进一步研究东亚砂藓耐旱机理奠定了基础。研究结果对研究苔藓植物的耐逆境胁迫具有重要指导意义。