论文部分内容阅读
在21世纪生物科学领域,合成生物学是一门正在迅速发展的新兴交叉学科,它从最基本的要素开始,先一步步建立零部件,再将这些零部件组织起来,建立出能体现不同功能的天然生物系统。由于传统的分子克隆技术获得重组DNA需要依赖PCR,酶切和连接等分子生物学手段,满足不了合成生物学研究的需要。每需要一个零部件,就必须设计一个独特的克隆方法,而且克隆一个组件过程中的中间产物一般不能应用到别的组件上,毫无疑问这是一种资源上的浪费。随着基因工程技术的迅速发展,如何提高目标蛋白在宿主菌的表达量和稳定性受到了国内外的高度重视,特别是一些具有生物活性的小分子多肽受到了高度关注。通过构建目的基因多拷贝的串联表达方式为小分子多肽的高效表达显现出了广阔的前景,而且多拷贝表达策略在一定程度上可以提高目的蛋白的表达量,为目的基因异源表达的工业化生产打下一定的技术基础。本文研究是在生物砖方法的基础上,通过PCR的方法在解脂耶氏酵母表达载体pINA1296启动子上游和终止子下游分别引入HindⅢ、NheⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ各两组酶切位点,最终成功地实现了载体的改造,命名为pINA1296I。为了便于重组子的筛选,本研究分别选取了来源于黑曲霉(Aspergillus niger)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露聚糖酶基因克隆到已改造好的pINA12961载体上,利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因。将构建好的一系列不同拷贝数载体转化解脂耶氏酵母polg菌株中,通过测定蛋白浓度和酶活来研究基因的剂量效应关系。通过测定摇瓶表达上清中的蛋白浓度及酶活,结果表明man-A随着拷贝数的增加蛋白量及酶活性也逐渐增加。5拷贝时蛋白量及酶活达到最大,6拷贝开始下降。该酶最适pH值为3.5,最适温度为65℃。70℃处理10分钟,活性仅剩余24%。pH2.0-8.0范围内室温处理1h,在pH3.0-6.5范围内最稳定,可保持95%以上的活性。Man-B蛋白浓度及酶活与拷贝数呈正相关性,6拷贝蛋白量及酶活达到最大,所以利用生物砖的方法体外串联多拷贝基因在一定程度上可以提高目的蛋白的表达量。