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第一部分针对子宫内膜癌相关基因的新型甲基化水平检测方法的构建
【目的】目的基因甲基化水平的确定是涉及DNA甲基化方面的生物学和医学研究的基础。用多个CpG位点的平均甲基化水平代表整个基因的甲基化水平的方法比仅用一个CpG位点的精确度高得多。当前已有几种方法可以用来检测几个CpG位点的平均甲基化水平，但是这几种方法都是成本很高，耗时长(可达数周)且劳动强度大的。最重要的是，这些方法都无法完成对多个位点平均甲基化水平的测量而难以被应用于子宫内膜癌的早期检测。因此，根据DNA链迁移过程的独特热力学性质，我们构建了一种DNA荧光探针并将其用于测量多个CpG位点的平均甲基化水平。反应过程的理论计算证实了我们探针的基本原理。以与子宫内膜癌相关的癌症抑制基因SF-1和VDR的启动子区域中的两个CpG位点为目标，我们人工合成不同错配数目的目标序列，利用探针检测其平均甲基化水平。最后我们观察实验结果，以此来证明该探针的实用性。
【方法】我们首先需要查阅相关文献选取子宫内膜癌相关基因，并设计相应的探针。然后我们人工合成不同错配数目的目标序列(为了节约成本，在方法原理验证阶段用错配代表甲基化)，利用设计好的探针检测平均甲基化水平。根据所得实验数据，最后我们建立平均甲基化水平与荧光值的标准曲线，评估方法的敏感度，并根据结果优化探针结构和反应条件。
【结果】链迁移探针在2-3个CpG位点基因的荧光强度检测中，其荧光强度以及转化率随错配数目呈等差数列排布。即随着错配位点数目的增加，荧光信号等比例降低。同时，具有相同错配位点数目的不同合成链所产生的荧光信号几乎相同。我们混合合成链，配置一系列混合样品后，在精密度为10%的情况下，伴随平均错配比例的提高，我们所测量到的荧光信号强度呈现线性下降。而且具有同一错配比例的不同DNA混合样品所产生的荧光信号几乎相等。
【结论】我们设计的新型链迁移探针体系从原理上可以实现一段DNA区域内2-3个CpG位点平均甲基化水平的检测。与目前其他的检测方法相比，我们的方法速度快，整个流程只需要2个小时左右。而且，我们的检测成本较低，仪器常见。因此，理论上我们的甲基化水平测量方法可以作为一种新的子宫内膜癌早期检测手段。
第二部分基因组DNA层面验证评估该方法并探讨相关基因位点作为子宫内膜癌诊断标志物的价值研究
【目的】第一部分实验都是在合成链上进行的，但是在进行实际临床样本的检测时，我们所检测的对象是基因组DNA。为了验证此方法在基因组层面的实用价值，我们在基因组层面设计相关实验检测甲基化水平。为了开发新的甲基化位点作为子宫内膜癌的诊断标志物，以癌症抑制基因SF-1和VDR的启动子区域中的两个CpG位点为目标，分别测量它们在子宫内膜癌患者和健康人中的平均甲基化水平。
【方法】我们首先需要制备0%，100%甲基化水平的基因组DNA标准品。根据相关文献报道，人类胎盘组织具有相对较低甲基化水平的基因组DNA，可作为0%DNA甲基化水平的标准品。于是我们从协和医院获取胎盘组织，提取人类胎盘组织基因组DNA并将其作为0%甲基化水平基因组DNA标准品。将胎盘组织基因组DNA经过NEB公司的甲基化酶(M.SssI)处理获得100%甲基化水平基因组DNA标准品。我们通过琼脂糖凝胶电泳和第一代测序证明我们成功制备了0%和100%甲基化水平的标准品。然后我们利用标准品配置平均甲基化水平分别为10%，20%，30%，40%和50%的样品，并通过测序证明上述样品制备成功。随后我们利用PCR对上述样品进行扩增并利用探针对产物进行检测，建立平均甲基化水平与荧光值的标准曲线。与焦磷酸测序结果进行对比，评估该方法测量基因组DNA目标区域平均甲基化水平的效果。最后，我们利用该方法进行临床标本的检测。我们从协和医院获取癌组织与正常组织的标本后，利用本课题发明的方法测量子宫内膜癌相关基因SF1和VDR启动子区的平均甲基化水平。将测量所得结果与临床病症进行对比，建立二者的相关性并评估SF-1和VDR能否作为EC的诊断标志物及其相应的临床意义。
【结果】在基因组DNA层面，我们用探针测量不同甲基化程度的基因组DNA样本后，结果显示伴随基因组DNA平均甲基化水平的增加，检测的荧光信号几乎成等差数列递增。这证明我们的方法可以在精密度为10%的情况下实现实际样品中两个CpG位点平均甲基化水平的检测。最后在对子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的DNA样品检测后，结果显示癌症病人的DNA产生的荧光强度均比正常人的高。结果与SF-1和VDR基因的抑制功能相吻合，从而坚定地证实了该探针的实用性。
【结论】我们设计的甲基化水平测量方法在基因组层面依然具有良好的实用价值。同时，VDR基因作为甲基化水平检测位点有望成为新的诊断标志物用于子宫内膜癌的早期检测。
【目的】目的基因甲基化水平的确定是涉及DNA甲基化方面的生物学和医学研究的基础。用多个CpG位点的平均甲基化水平代表整个基因的甲基化水平的方法比仅用一个CpG位点的精确度高得多。当前已有几种方法可以用来检测几个CpG位点的平均甲基化水平，但是这几种方法都是成本很高，耗时长(可达数周)且劳动强度大的。最重要的是，这些方法都无法完成对多个位点平均甲基化水平的测量而难以被应用于子宫内膜癌的早期检测。因此，根据DNA链迁移过程的独特热力学性质，我们构建了一种DNA荧光探针并将其用于测量多个CpG位点的平均甲基化水平。反应过程的理论计算证实了我们探针的基本原理。以与子宫内膜癌相关的癌症抑制基因SF-1和VDR的启动子区域中的两个CpG位点为目标，我们人工合成不同错配数目的目标序列，利用探针检测其平均甲基化水平。最后我们观察实验结果，以此来证明该探针的实用性。
【方法】我们首先需要查阅相关文献选取子宫内膜癌相关基因，并设计相应的探针。然后我们人工合成不同错配数目的目标序列(为了节约成本，在方法原理验证阶段用错配代表甲基化)，利用设计好的探针检测平均甲基化水平。根据所得实验数据，最后我们建立平均甲基化水平与荧光值的标准曲线，评估方法的敏感度，并根据结果优化探针结构和反应条件。
【结果】链迁移探针在2-3个CpG位点基因的荧光强度检测中，其荧光强度以及转化率随错配数目呈等差数列排布。即随着错配位点数目的增加，荧光信号等比例降低。同时，具有相同错配位点数目的不同合成链所产生的荧光信号几乎相同。我们混合合成链，配置一系列混合样品后，在精密度为10%的情况下，伴随平均错配比例的提高，我们所测量到的荧光信号强度呈现线性下降。而且具有同一错配比例的不同DNA混合样品所产生的荧光信号几乎相等。
【结论】我们设计的新型链迁移探针体系从原理上可以实现一段DNA区域内2-3个CpG位点平均甲基化水平的检测。与目前其他的检测方法相比，我们的方法速度快，整个流程只需要2个小时左右。而且，我们的检测成本较低，仪器常见。因此，理论上我们的甲基化水平测量方法可以作为一种新的子宫内膜癌早期检测手段。
第二部分基因组DNA层面验证评估该方法并探讨相关基因位点作为子宫内膜癌诊断标志物的价值研究
【目的】第一部分实验都是在合成链上进行的，但是在进行实际临床样本的检测时，我们所检测的对象是基因组DNA。为了验证此方法在基因组层面的实用价值，我们在基因组层面设计相关实验检测甲基化水平。为了开发新的甲基化位点作为子宫内膜癌的诊断标志物，以癌症抑制基因SF-1和VDR的启动子区域中的两个CpG位点为目标，分别测量它们在子宫内膜癌患者和健康人中的平均甲基化水平。
【方法】我们首先需要制备0%，100%甲基化水平的基因组DNA标准品。根据相关文献报道，人类胎盘组织具有相对较低甲基化水平的基因组DNA，可作为0%DNA甲基化水平的标准品。于是我们从协和医院获取胎盘组织，提取人类胎盘组织基因组DNA并将其作为0%甲基化水平基因组DNA标准品。将胎盘组织基因组DNA经过NEB公司的甲基化酶(M.SssI)处理获得100%甲基化水平基因组DNA标准品。我们通过琼脂糖凝胶电泳和第一代测序证明我们成功制备了0%和100%甲基化水平的标准品。然后我们利用标准品配置平均甲基化水平分别为10%，20%，30%，40%和50%的样品，并通过测序证明上述样品制备成功。随后我们利用PCR对上述样品进行扩增并利用探针对产物进行检测，建立平均甲基化水平与荧光值的标准曲线。与焦磷酸测序结果进行对比，评估该方法测量基因组DNA目标区域平均甲基化水平的效果。最后，我们利用该方法进行临床标本的检测。我们从协和医院获取癌组织与正常组织的标本后，利用本课题发明的方法测量子宫内膜癌相关基因SF1和VDR启动子区的平均甲基化水平。将测量所得结果与临床病症进行对比，建立二者的相关性并评估SF-1和VDR能否作为EC的诊断标志物及其相应的临床意义。
【结果】在基因组DNA层面，我们用探针测量不同甲基化程度的基因组DNA样本后，结果显示伴随基因组DNA平均甲基化水平的增加，检测的荧光信号几乎成等差数列递增。这证明我们的方法可以在精密度为10%的情况下实现实际样品中两个CpG位点平均甲基化水平的检测。最后在对子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的DNA样品检测后，结果显示癌症病人的DNA产生的荧光强度均比正常人的高。结果与SF-1和VDR基因的抑制功能相吻合，从而坚定地证实了该探针的实用性。
【结论】我们设计的甲基化水平测量方法在基因组层面依然具有良好的实用价值。同时，VDR基因作为甲基化水平检测位点有望成为新的诊断标志物用于子宫内膜癌的早期检测。