研究背景：恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一,在中国,已经成为疾病的死因之首,其发病率与死亡率每年都在升高。近些年,恶性肿瘤已经成为中国重要的公共健康问题。研究表明,乳腺癌是全球女性发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。最新发布的中国2015年癌症统计数据显示,女性常见的恶性肿瘤为：结直肠癌、支气管肺癌、乳腺癌、胃癌及食管癌,占据所有女性恶性肿瘤发病例数的近60%,其中乳腺癌发生率为女性所有恶性肿瘤中的15%,其发病率占据首位。乳腺癌的发病人群主要集中于30-59岁的女性,是45岁以下女性常见的癌症死亡原因。如今,越来越多的女性受到乳腺癌的威胁。因此,肿瘤发生发展机制的研究及乳腺癌的治疗已经成为目前研究者关注的热点。肿瘤的发生是一个复杂的、多基因驱动的过程。最新的研究表明,肿瘤的演化经过3个不同的阶段：突破阶段、扩张阶段与浸润阶段。每个阶段都涉及多种基因的驱动,在合适的局部环境下,多种基因相互影响最终导致了肿瘤的发生。不同肿瘤的发生涉及不同的生长调控通路的激活。乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤,其中激素受体在乳腺癌的发生发展中扮演着重要的角色,根据激素受体表达情况的不同可将乳腺癌分为4种不同的分子分型：Luminal A,Luminal B,人类表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)过表达与基底样型。其中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)与基底样型乳腺癌大约有80%的重合,是一类特殊类型的乳腺癌。TNBC大约占侵袭性乳腺癌的10%-20%,具有恶性程度高、侵袭能力强、复发率高的特点,与其他类型的乳腺癌相比,其5年生存率及总生存率更低。由于缺乏常见激素受体的表达,如雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)与HER-2,针对ER、HER-2的内分泌及分子靶向治疗并不能在这一类人群中获益。除此以外,TNBC恶性程度高,与其他类型乳腺癌相比肿瘤体积大、分期高、诊断初期发生淋巴结侵袭的几率高。尽管TNBC缺乏ER、PR及HER-2表达,有研究表明TNBC中还存在其他受体表达,如胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor,IGFR)、雄激素受体(androgen receptor,AR)等。AR与ER同为核激素受体,其在超过三分之一的TNBC中有表达,在体内、体外实验中均有证明AR能促进乳腺癌细胞的增殖。运用药物性AR阻断剂比卡鲁胺能有效抑制AR阳性TNBC细胞的增殖,使肿瘤生长减慢。为了进一步验证AR抑制剂的安全性及有效性,有临床研究表明,运用比卡鲁胺在ER(-)/PR(-)/AR(+)转移性乳腺癌中能获得19%临床获益率。另有一项Ⅱ期临床试验评估新一代AR抑制剂恩杂鲁胺在TNBC中安全性的研究也在进行中(NCT01889238).除此以外,有病例分析报道,一位55岁的AR阳性转移性TNBC女性,接受每日150mg口服比卡鲁胺治疗,4个月后达到了临床获益。AR与ER同为核激素受体,是配体依赖性转录因子,可作用于下游靶基因启动子结合位点调控下游基因的表达,影响细胞的功能。为了进一步研究AR在TNBC中的作用,我们在AR激动剂及拮抗剂处理后检测了细胞中p53、p73、p21及Cyclin D1的表达。p53是经典的抑癌基因,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。p53与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化密切相关。然而,p53在人类肿瘤中是突变率最高的抑癌基因。有研究表明,突变的p53特别是常见的突变位点的p53不仅会丧失野生型p53抑制肿瘤的作用,还会有诱导肿瘤发生的作用。在TNBC中,p53突变较为常见。而p73属于p53超家族的成员,在肿瘤中的突变发生率较低,1997年由学者Kaghad等发现位于1p36上的基因。p73基因在肿瘤中能发挥抑制肿瘤增殖、诱导凋亡的作用。p53在肿瘤细胞中能活化下游多种信号通路,细胞周期依赖性激酶抑制因子p21是p53信号通路中的关键因子,能够通过p53依赖或非依赖性途径引起细胞周期阻滞,影响肿瘤细胞的分化。研究目的与意义：TNBC是乳腺癌中的一特殊类型,侵袭性及恶性程度较高,复发率及死亡率一直居高不下。ER、PR及HER-2在TNBC中表达为阴性。靶向ER及HER-2的乳腺癌内分泌治疗及分子靶向治疗并不能在TNBC中获益,因此缺乏有效治疗方法的情况下,与其他类型乳腺癌相比TNBC总体生存率与无进展生存期更低。研究表明AR在TNBC中有一定量的表达,近些年AR成为乳腺癌中预后及治疗预测因子,越来越多的研究者关注AR在乳腺癌特别是TNBC中的作用。本研究旨在探究靶向AR是否能影响TNBC细胞增殖及相关蛋白(p53、p73、p21及Cyclin D1)的表达,为了解AR在TNBC中的作用及为其用于临床治疗提供理论依据。研究方法：本研究运用AR激动剂双氢睾酮(5-a-dihydrotestosterone,DHT)及拮抗剂比卡鲁胺(bicalutamide)处理TNBC细胞株(MDA-MB-231及Hs578T),观察AR对TNBC细胞增殖、凋亡的影响；并在细胞及小鼠水平检测双氢睾酮及比卡鲁胺处理后对AR及相关蛋白(p53、p73、p21、Cyclin D1)水平表达的变化,揭示了AR对p73、p21蛋白表达调控的可能机制。为深入理解AR在调控TNBC增殖中的作用与AR抑制剂用于AR阳性的TNBC治疗提供理论依据。本研究选择两株TNBC细胞株(MDA-MB-231,Hs578T)、Bab1/c小鼠作为研究对象进行研究。具体实验方法如下：1.通过MTT(溴化噻唑蓝四氮唑)比色法、细胞计数及流式细胞术检测AR激动剂双氢睾酮、拮抗剂比卡鲁胺对TNBC细胞增殖与凋亡的影响。2.通过免疫印迹(Western Blotting)检测双氢睾酮、比卡鲁胺处理后对肿瘤增殖相关蛋白p53、p73、p21及Cyclin Dl蛋白水平表达的影响。3.通过生物信息学在线预测软件预测AR与p73、p21结合位点的结合,运用染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)、琼脂糖凝胶电泳PCR验证AR与p73、p21的结合情况,对比双氢睾酮处理后与对照组相比结合位点的差异,探讨AR在双氢睾酮作用后对p73及p21表达调控的可能机制。4.通过用Babl/c小鼠及TNBC细胞株MDA-MB-231建立皮下移植瘤模型,建瘤成功后给予双氢睾酮、比卡鲁胺处理,观察用药后不同处理组肿瘤大小变化及通过免疫组化检测不同处理后肿瘤组织中AR、p73及p21的表达变化。实验结果：1.MTT实验证实,与对照组相比,AR激动剂双氢睾酮处理后TNBC细胞株MDA-MB-231及Hs578T增殖加快,细胞早期凋亡率减小；而拮抗剂比卡鲁胺作用后,TNBC细胞MDA-MB-231及Hs578T增殖受到抑制,早期凋亡率增加。2.细胞计数实验结果显示：随着时间的递增,细胞数目增加,与对照组相比,TNBC细胞株MDA-MB-231在双氢睾酮处理后细胞数目增加更快,抑制剂比卡鲁胺用药组细胞数目增加减慢。Hs578T细胞株实验组也得到相似的结果。3.免疫印迹实验结果显示：双氢睾酮能增加MDA-MB-231细胞株中AR、p53及Cyclin D1蛋白表达,减少p73、p21蛋白表达；比卡鲁胺抑制AR、p53及Cyclin D1蛋白表达,对p73、p21的表达作用则相反。而在Hs578T中双氢睾酮对p73表达调控作用并不明显。4.通过生物信息学在线软件预测到AR与p73、p21启动子区均有结合位点,ChIP实验发现AR能够与p73、p21基因启动子区结合,并且双氢睾酮的处理对结合有影响作用。5.双氢睾酮、比卡鲁胺处理裸鼠移植瘤出现肿瘤体积差异,双氢睾酮促进肿瘤生长,免疫组化结果显示AR表达增加,p73及p21表达均有下调,比卡鲁胺能抑制移植瘤生长,AR表达下调,p73及p21增加。结论：AR在MDA-MB-231及Hs578T两株TNBC细胞株中均有表达,运用AR激动剂双氢睾酮能促进AR蛋白水平在两株细胞中升高,而AR拮抗剂比卡鲁胺处理后AR表达水平有所下降。说明双氢睾酮及比卡鲁胺在两株细胞中是有效的。进一步实验证明,AR可通过雄激素双氢睾酮被活化,上调突变p53、下调p73及p21的表达,从而促进AR阳性的TNBC细胞的增殖。AR抑制剂比卡鲁胺可下调突变p53、促进p73、p21表达,诱导TNBC细胞株凋亡,抑制细胞增殖。ChIP实验还发现,AR能与p73、p21启动子区结合,AR对p73、p21的调控主要通过结合其启动子区实现。双氢睾酮处理能促进AR与p73及p21启动子区的结合。研究证明,AR对TNBC增殖有调控作用,抑制AR的活性能一定程度地抑制AR阳性乳腺癌细胞的增殖,我们认为靶向AR有可能使AR阳性的TNBC患者在临床上获益,延长生存时间。