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α-淀粉酶是迄今为止应用最为广泛,研究较多的一种酶制剂。来源于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因bla所表达的α-淀粉酶BLA已被商业化并得到广泛应用。但在实际应用过程中,BLA还具有一定的缺陷性,比如:(1)BLA的温度稳定性对某些生产工艺还是不能满足;(2)BLA的最适反应pH为6.0,在低p H中的反应效率低;(3)其表达量还有进一步提升的空间。因此开发稳定性更加优良表达量更高的α-淀粉酶是一项有意义的研究。本研究正是针对BLA的这些问题开展了相关研究工作。(1)通过对BLA的二级结构及蛋白序列进行分析,发现在其四个α-螺旋中有一般不出现在α-螺旋中的甘氨酸,分别是G81、G216、G268、G364,我们利用定点突变技术将α-螺旋中的甘氨酸突变成丙氨酸构建了四个突变体分别为G81A、G216A、G268A和G364A。对突变体及野生型BLA的热稳定性进行分析表明:突变体G81A、G216A和G268A的Tm值分别比野生型BLA提升了1.2oC,2.4oC和2.2oC。其中突变体G216A在70oC保温5 min后,突变体的酶活为未保温时酶活的37%,而野生型保温后的残余酶活为17%。(2)通过使用两个结构相似,最适pH几乎一致的淀粉酶BLA和BAA(来源于解淀粉芽孢杆菌)与最适p H为4.5的酸性淀粉酶PFA(来源于古菌炽热火球菌)进行蛋白序列比对,得到六个在蛋白BLA和BAA中保守,但在PFA中有差别的区段。通过定点突变构建相应突变体,并对突变体进行表达纯化后,分析得到BLA的264位点对其酸稳定性有一定的影响,其中该位点的突变体Q264D和Q264S酸稳定性相对于野生型BLA有较大提升,尤其是Q264S,在pH 4.5的条件下处理20 min时野生型只有60%的残余酶活,Q264S和Q264D分别有100%和80%的残余酶活。在此条件下处理60min时Q264S仍然能有50%的残余酶活,野生型残余酶活仅有25%。(3)利用随机突变的方法对高温α-淀粉酶基因bla进行随机突变,并对突变体进行筛选,我们分别得到了位于淀粉酶结构域A上的正突变体A390I和位于结构域C上的负突变体D401V,其中A390I使BLA在大肠杆菌中的可溶性表达量提高2.0倍,而负突变体D401V使BLA在大肠杆菌中的可溶性表达降低了160倍。我们通过生物信息学对BLA的结构进行分析得到A390和D401位点可能影响着结构域A和C之间的相互作用,我们通过后续分析和实验验证这种相互作用极大可能影响着蛋白质BLA在大肠杆菌中的可溶性表达。综上所述,本研究主要是以具有优良酶学性质的α-淀粉酶出发,对其进行分子改造和优化,期望获得高效表达的耐酸高温α-淀粉酶。本研究中对α-淀粉酶的分子改造有助于我们更好的理解α-淀粉酶的分子结构和功能的关系,为进一步改进和应用α-淀粉酶奠定理论基础。