研究背景:肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤微环境中的主要细胞组成部分和关键调控者,TAMs参与喉癌等肿瘤的生长,血管生成和淋巴管生成,肿瘤侵袭,转移和免疫抑制等过程。在过去的十年中,研究发现TAMs也可以促进化疗耐药性。化疗药物诸如紫杉醇和顺铂可以损伤肿瘤细胞有丝分裂过程并诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞的死亡将刺激TAMs扩增并募集其循环前体细胞,而增殖的TAMs将分泌细胞因子以促进肿瘤干细胞的增殖和抑制肿瘤细胞凋亡。研究表明,在结肠癌,胰腺癌和乳腺癌中,靶向TAMs可以抑制肿瘤进展并提高化疗效果。巨噬细胞是具有高度表型分化和功能异质性的免疫细胞,根据巨噬细胞活化后的不同表型,主要分为两个亚型,即1型巨噬细胞(M1)和2型巨噬细胞(M2)。M1和M2作为被彻底极化的活化巨噬细胞,是两个对立的极端状态,M1巨噬细胞是处于“经典的”活化状态,具有促炎和抑肿瘤的作用;而M2巨噬细胞是处于“可选择性”活化状态,具有抗炎和促肿瘤作用。肿瘤组织中巨噬细胞亚型的组成决定了 TAMs是抑肿瘤还是促肿瘤。在许多癌症类型中,M2巨噬细胞在TAMs中占主导地位,TAMs主要起着促进肿瘤的作用。因此,将TAMs从促肿瘤的M2重新极化为抗肿瘤的M1是一种非常有潜力的癌症治疗策略。自噬是一个将细胞中多余的或具有潜在毒性的物质包裹进入自噬小体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程。自噬在真核细胞中高度保守,参与调节细胞代谢和某些细胞器的更新。在巨噬细胞中,自噬不仅参与细胞内质量控制和代谢过程,对于细胞分化和重塑也至关重要。自噬可调控单核细胞的细胞发育,从而干扰巨噬细胞的分化。越来越多的证据表明巨噬细胞是连接自噬和机体免疫的桥梁之一。有研究报道,自噬水平的下调限制了 M2巨噬细胞的分化。因此,我们推测抑制自噬可以使TAMs从M2表型复极化为M1表型。首先我们发现自噬抑制剂氯喹(CQ)可以在体外使M2巨噬细胞复极化为M1表型,然后经检测发现重新极化后的巨噬细胞对人喉癌Hep-2细胞具有更高的吞噬活性,并且恢复了Hep-2细胞对顺铂(CDDP)的敏感性。最后,我们评估了 CQ在体内的治疗效果,结果表明,CQ可以在小鼠体内抑制Hep-2肿瘤细胞的生长并增强CDDP对肿瘤的治疗效果,在此过程中TAMs在CQ的诱导下重新极化为M1表型。研究目的:探究自噬抑制剂CQ是否可诱导M2巨噬细胞复极化为M1表型及CQ诱导的巨噬细胞复极化在体外和体内抑制喉癌细胞生长的机制。研究方法:1.诱导体外巨噬细胞极化从C57BL/6小鼠中分离出处于M0状态的骨髓衍生的巨噬细胞(BMDMs),并在IFN-丫和LPS条件下诱导BMDMs向M1表型极化,在IL-4条件下诱导巨噬细胞向M2表型极化。利用qRT-PCR检测极化后的巨噬细胞中精氨酸酶1(Arg1),甘露糖受体1(Mrc1),白介素-12(IL-12)和一氧化氮合酶(NOS2)的基因转录水平来评估巨噬细胞极化表型。2.证明自噬抑制剂CQ是否可以诱导体外M2巨噬细胞复极化为M1表型基于细胞中LC3-Ⅱ的表达水平与细胞自噬活性呈正相关,于是我们通过WB来检测不同表型巨噬细胞中的LC3-Ⅱ蛋白表达水平,从而比较不同表型巨噬细胞的自噬活性。接下来,探究抑制M2巨噬细胞的自噬活性是否会促使M2巨噬细胞再极化为M1表型,在M2巨噬细胞培养液中加入自噬抑制剂CQ处理24小时,对照组用PBS处理。然后利用qRT-PCR和WB分别检测CQ处理组和对照组中Arg1,Mrc1,IL-12,NOS2的RNA和蛋白表达水平,为了进一步验证巨噬细胞的复极化,我们使用流式细胞术(FACS)分别分析表达CD206(M2 marker)和 MHCⅡ(M1 marker)的细胞群。3.评估M2巨噬细胞复极化对巨噬细胞吞噬作用的影响,以及是否影响人喉癌细胞系Hep-2对CDDP的药物敏感性使用人喉癌细胞系Hep-2来检测复极化后的M2巨噬细胞的抗肿瘤活性。首先评估M2至M1复极化是否增强了吞噬作用对肿瘤细胞的直接杀伤力。使用CQ预处理以诱导M2巨噬细胞复极化,将复极化后的巨噬细胞与GFP标记的细胞系Hep-2共培养24小时,使用FACS检测与巨噬细胞标记物F4/80抗体同时出现的GFP信号,两种信号的并发则表示巨噬细胞对Hep-2-GFP细胞的吞噬行为。接着评估M2至M1复极化是否可以增强化疗效果,将经CQ处理的M2巨噬细胞和经PBS处理的M2巨噬细胞预培养24小时,然后分别收集条件培养基用来培养Hep-2,再将化疗药物CDDP添加到培养基中,孵育48小时后使用膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡测定法检测Hep-2的细胞凋亡水平。另外,通过MTT实验检测了 CQ对体外Hep-2细胞活力的影响。4.探究CDDP,CQ以及CQ/CDDP联合治疗在体内的抗肿瘤活性建立了人喉癌细胞系Hep-2在小鼠体内荷瘤实验模型,将人喉癌细胞系Hep-2皮下注射到nu/nu小鼠右后方的皮肤下,当肿瘤大小达到50mm3,每三天给予CDDP,CQ,CDDP+CQ或对照PBS治疗,共给予治疗五次。计算各组肿瘤的平均体积和平均重量来绘制肿瘤生长曲线。然后使用PCNA测定法检测肿瘤组织切片中的Hep-2细胞增殖情况,使用TUNEL测定法检测肿瘤组织切片中的细胞凋亡情况。5.探究CQ是否通过抑制自噬以及诱导TAMs复极化而影响体内肿瘤生长通过Western Blot实验检测脂化微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ)的表达水平来表征肿瘤组织中的自噬活性。通过流式细胞仪检测经过PBS,CQ,CDDP,CQ+CDDP四种不同治疗后的肿瘤组织中的CD11b+F4/80+CD206+M2表型巨噬细胞和CD1 1b+F4/80+MHCⅡ+M1表型巨噬细胞。研究结果:1.M1和M2巨噬细胞体外极化Arg1和Mrc1是表征M2巨噬细胞的特征基因,而IL-12和NOS2是表征M1巨噬细胞的特征基因。qRT-PCR结果表明,经IL-4诱导的巨噬细胞中Arg1和Mrc1的RNA表达水平均明显高于LPS/IFN-γ诱导组(P<0.0001****);相反地,经IL-4诱导的巨噬细胞中IL-12和NOS2的RNA表达水平均明显低于LPS/IFN-γ诱导组(P<0.0001****)。这些结果说明,LPS/IFN-γ成功诱导了 BMDMs向M1表型极化,IL-4成功诱导了 BMDMs向M2表型极化。2.自噬抑制剂CQ在体外诱导M2巨噬细胞复极化为M1表型WB光密度分析结果表明M2巨噬细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显高于M1巨噬细胞(P<0.001***)。qRT-PCR和WB结果都表明,经CQ处理的M2巨噬细胞中ARG1,MRC1的蛋白表达水平明显低于对照组,而IL-12和NOS2的蛋白表达水平明显高于对照组。流式结果表明,经CQ处理后的M2巨噬细胞表面CD206水平明显低于对照组,而MHCⅡ水平明显上调。综上可知,CQ诱导了M2巨噬细胞重新极化为M1巨噬细胞。3.M2至M1复极化可增强巨噬细胞的吞噬作用并增加肿瘤细胞对CDDP的敏感性体外吞噬实验结果表明,经CQ处理的M2巨噬细胞中的GFP信号强度明显高于对照组,说明CQ处理诱导的M2至M1的复极化显著增强了巨噬细胞对人喉癌Hep-2细胞的吞噬作用。膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡实验结果表明,M2巨噬细胞降低了 Hep-2细胞对CDDP的敏感性,导致顺铂处理时Hep-2细胞凋亡水平明显下调,但M2到M1的复极化恢复了 Hep-2细胞对CDDP的敏感性,增加了顺铂处理时Hep-2细胞的凋亡水平。4.CDDP,CQ和CQ/CDDP联合疗法在体内的抗肿瘤活性与对照组相比,CQ处理显著抑制了肿瘤体积和重量。与CDDP处理组相比,CQ/CDDP联合处理具有更好的肿瘤抑制效果。PCNA定量分析结果表明,CQ/CDDP联合处理组中PCNA 阳性细胞所占比例明显减少,这表明CQ/CDDP联合处理可更有效地抑制Hep-2细胞增殖。TUNEL定量分析结果表明,CQ/CDDP处理组中TUNEL阳性细胞所占比例明显增多,这表明CQ/CDDP联合处理可以显著促进Hep-2细胞凋亡。综合以上结果表明,CQ具有在体内抑制肿瘤生长和提高CDDP治疗效果的作用。5.CQ抑制Hep-2肿瘤中的细胞自噬并使TAMs复极化为M1表型与对照组相比,CQ处理组及CQ/CDDP联合处理组肿瘤组织中LC3-Ⅱ水平都显著增加(P<0.001***);CDDP处理组与对照组相比,LC3-Ⅱ水平无显著性差异。流式分析结果表明,CQ处理使肿瘤组织中M2巨噬细胞所占细胞百分比降低了50%以上(CQ:P<0.005**;CQ+CDDP:P<0.001***),M1巨噬细胞所占百分比增加了 200%以上(CQ:P<0.005**;CQ+CDDP:P<0.005**)。综合以上这些数据表明CQ抑制了肿瘤组织中的细胞自噬,并使M2巨噬细胞重新极化为M1表型,从而形成了以M1巨噬细胞占主体的TAMs群体。研究结论:在本课题中,我们证明了 CQ作为一种自噬抑制剂可以将TAMs从M2表型重新极化为M1表型。CQ可以在小鼠体内抑制喉癌Hep-2细胞的生长,并且很大程度上增强了 CDDP的治疗效果,这与CQ诱导的TAMs复极化有关。