目的:我国已成为世界糖尿病第二大国,胰岛移植是治疗糖尿病最有前景的手段之一,而免疫排斥和供体短缺问题是胰岛移植面临的主要难题,免疫排斥问题使胰岛生存期不理想进而需要多次胰岛移植,进一步加剧了供体短缺的问题。胰岛移植术后大量昂贵的的免疫抑制剂也给患者带来了沉重的负担。本课题以抑制T细胞诱导胰岛移植耐受为中心,从两个方面开展研究,一方面开发免疫抑制效果更好、副作用更小、成本更低的免疫抑制剂,另一方面研究记忆性T细胞(Memory T cells,Tm)在胰岛移植中的作用机制和抑制方法。　　 方法:一方面我们尝试探索As2O3对于胰岛移植免疫排斥反应的抑制作用:首先通过淋巴细胞转化实验、凋亡实验等体外实验研究As2O3对于T细胞的抑制作用和机制,以及对胰岛细胞的毒性;其次,建立小鼠同种异体胰岛移植模型,研究As2O3或在联合使用。Rapa的情况下对于胰岛生存期的影响;最后,通过对T淋巴细胞亚群、Th1/Th2相关炎症因子、移植物病理切片等进行研究,试图阐明As2O3抑制T细胞诱导胰岛移植耐受的机制以及作为免疫抑制药物的可行性。另一方面,系统研究了糖尿病患者体内存在的同种反应性Tm细胞和胰岛组织特异性的Tm细胞对胰岛移植物的影响及解决方法:首先为了研究同种反应性Tm细胞介导的加速排斥的作用及机制,我们通过对受体同品系小鼠进行同种异体皮肤移植,使其经受预致敏并产生大量同种反应性Tm细胞:其次,通过提取这些CD4+和CD8+同种反应性Tm细胞并过继转移给naive的受体小鼠,建立加速性排斥模型,通过生存期的变化研究这些Tm细胞对胰岛移植物生存期的影响,并尝试使用单克隆抗体特异的阻断CD134和CD122信号通路来特异的抑制这些Tm细胞的作用,延长移植物的生存期;再次,在序贯胰岛移植模型中,通过生存期的变化来验证阻断CD134和CD122信号通路分别抑制CD4+ Tm细胞和CD8+ Tm细胞对于其胰岛移植物生存期的影响,并通过对T淋巴细胞亚群、Th1/Th2相关炎症因子、移植物病理切片等实验手段,试图阐明生存期变化的机制;最后,以NOD小鼠为模型,研究发生严重糖尿病NOD小鼠中Tm细胞比例的的变化,并通过将这些Tm细胞过继转移给NOD-scid小鼠,观察NOD-scid的发病情况,以验证NOD小鼠体内Tm细胞是否为胰岛组织特异性Tm细胞,之后尝试通过使用单克隆抗体阻断CD134L和CD122信号通路,抑制胰岛组织特异性Tm细胞,保护胰岛免受Tm细胞介导的破坏作用。　　 结果:在关于As2O3作为胰岛移植免疫抑制剂的可能性以及作用机制的研究中,我们有以下结果:首先,体外实验中,淋巴细胞转化实验证实2～4μMAs2O3可以显著抑制T细胞的增殖,并且具有剂量依赖性,并且在淋巴细胞转化试验体系中加入外源IL-2不能逆转As2O3对T细胞增殖的抑制作用,说明As2O3的作用机制并不是诱导T细胞无能;其次,T细胞凋亡实验表明As2O3可以诱导T细胞的凋亡,2μMAs2O3诱导T细胞凋亡率达到80％,4μM As2O3诱导T细胞凋亡率达95％,凋亡实验结果与混合淋巴细胞反应结果相同,均是在2-4gM As203即具有非常好的效果,说明诱导凋亡才是.As2O3抑制T细胞增殖的主要机制;再次,体内试验中,As2O3联合半剂量Rapa可以抑制免疫排斥反应,显著延长胰岛移植物的生存期,达到甚至超过全剂量Rapa的效果(有1/5的受体鼠移植生存期＞100天达到耐受);最后,我们通过对受体移植物、血清以及脾脏中T细胞亚群的检测发现,As2O3联合半剂量Rapa可以显著降低受体鼠CD4+、CD8+ T细胞的比例以及血清中Th1/Th2因子的浓度,同时移植物中炎细胞浸润数量也相应减少,这些结果表明,As2O3与半剂量的Rapa联合,在降低Rapa用量的同时,可以对供体反应性T细胞进行克隆清除,减少炎细胞向移植物浸润,从而抑制了T细胞介导的排斥反应,保护了抑制物,延长了移植物的生存期。在关于Tm细胞在胰岛移植中的作用及机制的研究中,我们主要由以下发现:首先,同种反应性Tm细胞过继转移胰岛移植模型中,受体鼠均可以加速排斥胰岛移植物,说明同种反应性的Tm细胞对胰岛移植物确实是很大的威胁;其次,用药干预结果表明,阻断CD134L和CD122信号通路可以分别很好的抑制CD4+。Tm细胞和CD8+ Tm细胞,诱导CD4+ Tm细胞或CD8+ Tm细胞胰岛移植物的耐受;再次,我们进一步在序贯模型中验证了此结果,发现序贯模型对胰岛移植物的排斥反应更为强烈,无药物处理组生存期更短,通过使用单克隆抗体阻断CD134L和CD122信号通路后可以延长胰岛移植物的生存期;通过对受体脾脏淋巴细胞亚群、血清、移植物的检测发现,联合使用抗体后,受体鼠外周CD4+ Tm细胞、CD8+ Tm细胞的比例明显降低,Tregs比例明显升高,血清Th1型细胞因子浓度下降,耐受诱导因子浓度升高,移植物中炎细胞浸润程度降低,炎症因子表达量也降低,表明联合用药通过克隆清除、克隆无能、诱导调节性T细胞的机制抑制了Tm细胞,具有诱导供体特异性免疫耐受的可能;最后,我们对胰岛组织特异性Tin细胞的作用进行了研究,结果发现严重发生糖尿病的NOD小鼠体内的Tm细胞显著升高,将这些Tm细胞过继转移至NOD-scid小鼠中,可以诱导其发生糖尿病,表明1型糖尿病患者体内的Tm细胞确实是胰岛组织特异性Tm细胞,对胰岛组织是很大的威胁。而阻断CD134L和CD122信号通路可以分别很好的抑制胰岛组织特异性CD4+ Tm细胞和CD8+ Tm T细胞。　　 结论:通过本研究,一方面我们首次证实传统中药As2O3在胰岛移植模型中可以通过诱导凋亡对供体反应性T细胞进行克隆清除,从而抑制T细胞介导的排斥反应的发生,同时对胰岛破坏作用较小,有可能成为临床胰岛移植的免疫抑制剂;另一方面,针对胰岛移植可能面临Tm细胞介导的加速性排斥的问题,我们首次从同种异体反应性Tm细胞和组织特异性Tm细胞两个切入点入手,证实了Tm细胞确实可以介导胰岛移植物的加速性排斥,是胰岛中应当予以重视的问题,而阻断CD134L和CD122信号通路可以分别有效的抑制CD4+ Tm细胞和CD8+ Tm细胞的作用,通过包含克隆清除、克隆无能和诱导Treg等作用机制诱导胰岛移植物的长期存活。本研究的两个成果对于临床胰岛移植的大规模开展和进一步研究具有一定的借鉴意义。