目的:胃癌是消化道最常见恶性肿瘤之一,根据国际癌症研究机构首次在2012年公布的全球癌症统计,死亡率第三,发病率呈现10倍增长。因此对胃癌特别是胃腺癌的诊治研究显得极其重要;资料显示,大多数胃腺癌患者确诊时已处进展期,5年术后生存率低于30%,而早期胃腺癌患者术后5年生存率高于90%,这说明胃腺癌治疗最重要的途径之一就是早期诊断、早期治疗。目前胃癌早期诊断的方法,主要采用胃镜,因其检查有一定的痛苦而不易被大众接受,早期诊断的另一条途径是分子标志物,但目前又缺乏早期胃腺癌特异分子标志物，所以亟需发现新的早期胃腺癌特异分子标志物,建立相应的检测方法,实现早期诊断,将对早期胃腺癌的筛查及诊治有着重大意义。基于此,本项目的研究目的就是在前期工作的基础上,分离提取、纯化5种新的早期胃腺癌标志物,对其进行初步的化学表征,并建立检测方法、进行临床前实验室检测研究,以揭示其诊断价值。研究内容及方法:1.早期胃腺癌细胞特异性适配子的筛选。(1)收集组织标本,利用胶原酶Ⅳ方法分离得到早期胃腺癌组织细胞和正常胃粘膜上皮细胞。(2)以早期胃腺癌细胞为靶细胞,正常胃粘膜上皮细胞为反筛细胞,运用SELEX技术从ssDNA文库中筛选出早期胃腺癌组织细胞特异适配子,并通过DNA测序及RNA-Structure在线分析软件对其进行一级、二级结构分析。(3)利用常规方法对适配子特异性和亲和力进行分析检测,获得高特异性、高亲和力的适配子,即Aptamer(Ap)。2.靶膜蛋白的制备及表征利用上述获得的高特异性、高亲和力适配子,采用适配子-生物素-链酶亲和素磁珠方法,分离提取、纯化靶膜蛋白;利用光谱法、电泳法进行纯度鉴定,采用Maldi-TOF-TOF质谱法进行鉴定,经NCBI数据库检索分析,以证实是否为新的早期胃腺癌分子标志物,并命名为Early gastric adenocarcinoma(EGA)。3.EGA检测方法的建立及检测分析(1)检测方法的建立:利用荧光素标记的适配子识别结合早期胃腺癌细胞膜上的标志物EGA,经荧光光度分析,得到一系列荧光吸收值,以EGA7浓度对荧光吸收值作图,绘制工作曲线,经线性回归得出线性方程;灵敏度分析:配制一定浓度的EGA7溶液,将其稀释成系列浓度溶液后进行荧光光度分析,得到系列荧光吸收值,最低吸收值所对应的EGA7浓度即为检测灵敏度;重复性分析:批内重复试验10次,得批内变异系数,批间重复试验10次,得批间变异系数;取工作曲线线性范围上限EGA7浓度(3000ng/μl)溶液为检测样本,配制系列浓度的Ap7(μmol/l)溶液,经荧光光度分析得到一系列荧光光度吸收值,以荧光吸收值对Ap7浓度作图得到曲线,取曲线平台期最低浓度值做检测试剂浓度。以证实方法的科学性。(2)检测分析:以组织细胞作为生物样本,实验分为早期胃腺癌细胞、进展期胃腺癌细胞、正常胃粘膜细胞,经检测分析,揭示标志物的诊断价值。4.血清源样本标志物的检测分析采用血清作为生物样本来源,利用所建紫外分光光度法进行检测分析,并通过SDS-PAGE对血清源标志物EGA进行鉴定。结果:1.通过胶原酶Ⅳ方法分别分离出早期胃腺癌组织细胞、正常胃粘膜上皮细胞、进展期胃腺癌组织细胞,经免疫组化法鉴定达到实验要求纯度。通过SEILEX技术12轮筛选,获得22个早期胃腺癌细胞特异性适配子。经测序和RNA Structure在线分析软件分析,得到一级、二级结构,经特异性、亲和力分析最终得到5个高特异性、高亲和力适配子,即Ap1、Ap7、Ap12、Ap20、Ap26。2.利用上述5个适配子分别制备出相对应的目标靶蛋白,分别是EGA1、EGA7、EGA12、EGA20、EGA26,通过光谱扫描法、电泳法进行纯度鉴定,证实得到电泳纯EGA;经Maldi-TOF-TOF质谱分析及NCBI数据库检索对比分析证实:EGA7为Peroxiredoxin-4即过氧化物酶,EGA 12和EGA26均为dermcidin isoform 1 preproprotein[Homo sapiens]即神经存活因子亚型 1 前原蛋白[智人],EGA1、EGA20均为Keiatinl即角蛋白,推测可能是角蛋白污染。前三者均为尚无人报道的早期胃腺癌标志物。3.工作曲线的线性方程为:Y=1.6390X-912.16,(R2=0.9504),线性范围:556.53<X<3000ng/μl;批内变异系数<5,符合现行通用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)文件的要求,批间变异系数>5;检测灵敏度为300ng/μl;检测试剂[荧光-Ap7]浓度为l0μmol/l。SPSS软件分析显示,早期胃腺癌细胞组与正常胃粘膜细胞组相比有显著性差异,P＜0.01;早期胃腺癌细胞组与进展期胃腺癌细胞组比较有显著性差异,P<0.01。正常胃粘膜细胞组与进展期胃腺癌细胞组比较有显著性差异,p<0.014.紫外分光光度法分析血清源生物样本,结果显示5种靶蛋白均有吸收;经SDS-PAGE电泳鉴定显示有交叉反应,该方法不能用于检测血清源标志物,但电泳结果同时显示在血清源生物样本中可检测出EGA7、EGA12。结论:1.筛选出5个高特异性、高亲和力早期胃腺癌细胞适配子。2.制备出电泳纯5种目标靶蛋白(EGA1、EGA7、EGA12、EGA20、EGA26),并经过初步的化学表征以及NCBI数据库检索分析,证实EGA7为Peroxiredoxin-4 即过氧化物酶,EGA12 和 EGA26 均为 dermcidin isoform 1 preproprotein[Homosapiens]即神经存活因子亚型1前原蛋白[智人],同时作为肿瘤标志物尚无人报道,因此可作为新的早期胃腺癌标志物。3.建立了在组织细胞水平上检测EGA7标志物的方法,经过初步的检测分析证实:EGA7可以作早期胃腺癌的高度特异性指标,有一定的诊断价值。