论文部分内容阅读
急性肝胰腺坏死合综合症（Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS）是近年来影响凡纳滨对虾养殖业发展的重要疾病之一。2009年以来,AHPNS使得亚洲对虾产量大幅下降,给亚洲养虾业带来了巨大的经济损失,我国以凡纳滨对虾养殖为主的对虾养殖业亦受到较大冲击。2013年,全球水产养殖联盟（Global Aquaculture Alliance,GAA）发表声明,明确了AHPNS的病原体是副溶血弧菌。据报道,该病原菌通过效应蛋白PirA与PirB产生毒力,病虾消化器官颜色苍白,肝胰腺萎缩,空肠空胃,发病13天内死亡率可达到100%。目前对于AHPNS的致病机理尚未研究清楚,尚无有效的防治手段见诸报道。本文通过分离得到了不同来源的凡纳滨对虾AHPNS致病菌,进行了分子分型,获得江苏地区急性肝胰腺坏死综合症的分子流行病学资料;通过致病性弧菌拮抗菌的筛选相关研究,为该病的生态防控提供技术资料。20172018年间,江苏省沿海地区连云港、盐城和南通等市部分养殖场出现不同程度的凡纳滨对虾急性死亡,发病对虾呈现为空肠空胃,肝胰胰萎缩或肿涨,表现出AHPNS发病的典型症状。从上述数十家养殖场采集不同苗种来源、不同生长阶段、不同发病特点以及不同养殖模式的健康和疑似患AHPNS的凡纳滨对虾,无菌解剖其肝胰腺,分离得到642株细菌,分别采用急性肝胰腺坏死合综合症致病性相关基因pirAvp引物AP3以及细菌16S rRNA通用引物进行扩增,确认并获得28株凡纳滨对虾AHPNS致病性副溶血弧菌,根据不同的来源、模式等对所得菌株进行了分类。应用脉冲场电泳（PFGE）技术,对28株分离自江苏省内不同地区、不同养殖模式、不同生长阶段的对虾AHPNS发病个体肝胰腺的致病性副溶血弧菌进行分子分型研究,最终得到了副溶血弧菌的4个主要的PFGE簇（G 1-G4）,24个谱型,带型间相似性达到86.1%-100%,表明各菌株亲源关系较近,PFGE的分型结果与样品来源的生长地点、养殖模式、发病症状、苗种来源、对虾生长阶段等具有相关性,说明在江苏省内由副溶血弧菌引起的凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症的发生已经存在流行趋势。4个不同PFGE聚类簇的谱型存在一定的差异,这与28株菌的来源、养殖模式、发病症状以及发病对虾不同生长阶段有关。本研究初步建立了江苏省内凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症弧菌的PFGE数据资料,以便在预警防控过程中快速将不同发病样品或可疑对虾样品的副溶血性弧菌PFGE谱带与本研究结果进行比较。根据同一来源对虾个体具有共同的遗传物质,在PFGE谱带中表现出相同的指纹图谱这一原理,分析菌株间的亲缘关系,研究某疾病的传染源、流行范围等,并在此基础上进行疾病的预警预控,采取有效措施防控凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症。从江苏南部沿海滩涂沉积物中分离得到252株细菌,以14株凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症致病性副溶血弧菌为指示菌,初筛和复筛后,获得1株拮抗效果较好的菌株H 0011;通过形态观察、生理生化特性和16S rRNA基因序列鉴定为普罗威登斯菌。利用普罗威登斯菌H 0011对凡纳滨对虾进行高密度胁迫安全性试验结果,试验期间浸浴组和投喂组对虾状态良好,没有发病和死亡现象,该菌株对凡纳滨对虾是安全的。菌株H 0011的发酵工艺结果,该菌最佳发酵生长条件为温度为30℃、盐度为10‰、pH为8、培养时间为20 h。本文首次对江苏地区不同苗种、不同地区、不同生长时期、不同养殖模式、不同死亡特点的凡纳滨对虾进行了AHPNS致病性弧菌收集及分子分型,认为江苏省内凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症已形成流行趋势,为进一步开展江苏地区急性肝胰腺坏死综合症的分子流行病学研究提供技术资料;首次获得了对凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症具有防控作用的高效拮抗作用菌,为该病的防控提供了新的思路。