一、单中心176例成人混合表型急性白血病患者的临床及遗传学特征研究目的:回顾性分析成人混合表型急性白血病（mixed-phenotype acute leukemia,MPAL）患者的临床和实验室特征,比较MPAL不同亚型之间的实验室、遗传学特征及临床预后。方法:1.系统性收集2006年1月至2019年11月期间至本中心就诊的247例拟诊为MPAL患者的临床及实验室资料,对比分析符合2016年WHO分型标准和仅符合EGIL标准的MPAL患者的实验室特征。2.根据2016年WHO分型标准将MPAL分为五种亚型:t（9;22）/BCR-ABL1（Ph+）、t（v;11q23）/KMT2A重排（KMT2A-r）、T淋系/髓系非特指型（T/My）、B淋系/髓系非特指型（B/My）及MPAL非特指型罕见类型（B/T或B/T/My）,由于KMT2A-r和B/T/My病例数少,本研究比较了 Ph+、T/My、B/My及B/T四组的临床、实验室、遗传学特征及预后生存特点。结果:1.本研究共收集了 247例拟诊为MPAL患者的临床及实验室资料,包括12例儿童和235例成人,其中成人病例中176例符合2016年WHO分型标准（WHO组）,50例符合EGIL标准但不符合2016年WHO分型标准（EGIL组）,9例均不符合两种诊断标准。176例WHO组与50例EGIL组相比较除t（9;22）（q34;q11）发生率较高外（25.9%vs 10.9%,P=0.031）,其余临床和实验室特征均无明显差异。2.176 例 WHO 组成人 MPAL 患者以 T/My（48.9%,86/176）为主,其次为 Ph+（23.9%,42/176）、B/My（20.5%,36/176）、B/T（4.0%,7/176）、KMT2A-r（2.3%,4/176）及 B/T/My（0.6%,1/176）。T/My组以男性多见,B/My组以女性多见,Ph+组常伴高白细胞计数及高LDH水平;形态学方面基于FAB分型,T/My组主要表现为M1/M2及M4/M5的髓系单核系特征,B/T组表现为ALL/M0淋系特征;细胞遗传学方面异常核型检出率63.6%,T/My组复杂核型检出率高于其他组,Ph+组中35.7%伴附加染色体异常,B/My组以正常核型为主;免疫表型方面以T/M（49.4%）和 B/M（46.0%）为主,B/T（4.0%）和 B/T/M（0.6%）发生率低。3.成人MPAL患者诱导治疗一疗程完全缓解率（complete remission,CR）为69.4%,诱导化疗方案中ALL方案CR率为85.7%,与AML+ALL联合方案（69.5%）或CAG预激方案（75.0%）无明显差异,虽然高于AML方案（46.2%）,但未达到统计学差异（P=0.077）。T/My、Ph+、B/My三组间CR率及总生存率均无明显差异。年龄≥60岁的患者预后差。48例成人MPAL患者行异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）,移植组的 2 年总生存率及无事件生存率均明显高于非移植组（2年总生存率:71.1%±7.1%vs 36.5%±7.2%,P＜0.0001;2年无事件生存率:61.3%±7.2%vs 26.2%±6.3%,P＜0.0001）,allo-HSCT能够改善成人MPAL患者的预后,但不同移植方式对移植后总生存率无明显影响。多因素分析显示诱导治疗获得CR以及allo-HSCT均是改善患者预后的独立影响因素。结论:1.2016年WHO分型与EGIL分型诊断的MPAL患者的临床和实验室特征无明显差异。2.MPAL不同亚型（Ph+、T/My、B/My、B/T）的遗传学及免疫表型特征具有一定差异,但对临床预后无明显影响。3.Allo-HSCT能够改善成人MPAL患者的临床预后。二、成人混合表型急性白血病患者的基因组学及转录组学研究目的:1.比较MPAL不同亚型（Ph+、T/My、B/My、B/T）的突变谱、基因表达谱、拷贝数变异及融合基因转录本的特点及临床意义。2.比较MPAL与急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）的突变谱及表达谱差异。3.建立基于突变谱和表达谱特征的MPAL新的分型标准。方法:1.采用全外显子测序（WES）及下一代靶向测序（NGS）技术分析成人MPAL患者的单核苷酸变异（SNVs）和插入缺失（indels）变异,其中WES3例,NGS 104例,总结MPAL患者突变谱特征及其对临床预后的影响,并与文献中AML和ALL的突变谱进行比较。2.采用微阵列比较基因组杂交（array-CGH）技术分析11例MPAL患者（包括7例Ph+、3例T/My和1例B/T）的基因组大片段缺失或扩增异常。3.采用基因表达谱芯片（GEP）及转录组测序（RNA-seq）技术比较MPAL与AML、ALL的表达谱差异。25例MPAL患者进行了 GEP检测,与文献中AML、ALL的GEP数据比较,包括105例B-ALL、75例AML及35例T-ALL;316例急性白血病患者进行了 RNA-seq检测,包括 89 例 MPAL（WHO 组 78 例+EGIL 组 1 1 例）、133 例 AML、53 例 B-ALL 及 41 例 T-ALL。同时分析162例进行多重PCR和/或RNA-seq检测的MPAL患者的不同融合基因转录本特征。4.整合基因组学和转录组学特征对MPAL提出新的亚型,并分析不同亚型的临床及实验室特征。结果:1.T/My、Ph+、B/My三组间具有不同的突变谱和表达谱特征,而B/T与T/My相似。T/My突变个数多于Ph+和B/My,以CEBPA、NOTCH1、DNMT3A突变为特征,主要活化T细胞受体信号通路;Ph+组以RUNX1突变为主,上调的通路主要包括MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路及RAS信号通路等BCR-ABL1经典的下游信号通路;B/My组主要上调的信号通路为PI3K-Akt信号通路;B/T组以NOTCH1和PHF6突变为主。通过相关性分析显示CEBPA突变与GATA2突变、NOTCH1突变与JAK3/KRAS/IDH2突变、DNMT3A突变与ETV6/IDH2突变有相关性,而NOTCH1突变与CEBPA和RUNX1突变互排。突变组与野生型组在CR率和总生存率方面均无明显差异,但在未移植组患者中JAK3突变组预后差（2年总生存率:0%vs 42.7%±9.6%,P＜0.0001;2年无事件生存率:0%vs 30.8%±8.9%,P＜0.001）。多因素分析发现JAK3突变是预后不良的独立影响因素,而allo-HSCT是预后良好的独立影响因素。2.我们进一步比较了 T/My、B/My MPAL与文献中AML、B-ALL和T-ALL的突变谱,T/My MPAL与AML相比,转录因子及NOTCH通路相关基因突变发生率高,累及基因包括CEBPA、WT1、PHF6、GATA2、ETV6 以及 NOTCH1,而 FLT3 突变发生率低于 AML 患者;T/My MPAL与T-ALL相比,RTK-RAS信号转导通路相关基因突变发生率高,累及基因包括NRAS、KRAS、FLT3,而NOTCH1基因突变发生率低于T-ALL患者;B/My MPAL的DNMT3A突变发生率低于AML,与B-ALL突变谱相比无明显差异。3.11例MPAL患者进行了 array-CGH检测,共检出436个拷贝数变异,包括293个缺失和 143 个扩增,7 例 Ph+组中扩增占 21.0%（61/291）,缺失占 79.0%（230/291）,4 例 T/My＆B/T组中扩增占56.6%（82/145）,缺失占43.4%（63/145）,Ph+组拷贝数的缺失发生率明显高于T/My＆B/T组（P＜0.0001）。162例成人MPAL患者中64例（39.5%）检出融合基因,最常见的融合基因为 BCR-ABL1,占 25.9%（42/162）,其中 81.0%（34/42）编码 P210 融合蛋白,19.0%（8/42）编码P190融合蛋白;其次为SET-NUP214及ZNF384重排,各占2.5%（4/162）;KMT2A重排及PICALM-MLLT10发生率低,各占1.9%（3/162）。成人MPAL患者检测到3个新的融合基因,包括 NRIP1-BCL2L1、IKZF1-TRB 及 MED14-HOXA9。B/My 组融合基因检出率高于 T/My 组（29.0%vs 10.0%,P=0.028）,以 ZNF384 重排（9.7%,3/31）为主,而 T/My 组最常见的是 PICALM-MLLT10（3.8%,3/80）。4.通过25例MPAL与215例文献中AL的GEP分析发现,MPAL可以分别聚类到不同AL组,根据与不同AL表达谱相似性,将MPAL分为B-ALL-like（56%）、T-ALL-like（24%）和AML-like（20%）,并且诱导化疗方案与表达谱分组一致时CR率高于不一致时,但未达到统计学差异（78.6%vs33.3%,P=0.191）。我们进一步分析了 316例AL的RNA-seq结果,根据表达谱特征,MPAL 也可分为 B-ALL-like（37.1%）、T-ALL-like（33.7%）和 AML-like（29.2%）,但诱导方案是否与表达谱分组匹配对CR率无影响（P=1.000）。5.值得注意的是,316例AL样本的转录组测序结果经t-SNE及无监督聚类分析均提示有两个群体单独聚类成簇:cluster1和cluster2,cluster1包括6例T/My MPAL和3例ETP-ALL,77.8%（7/9）的患者伴有FLT3突变,免疫表型均表达T淋系标记CD7、CD2、cCD3及髓系标记CD13、CD117,CD34 阳性率 88.9%,推测可以利用流式标记 CD7+、CD2+、cCD3+、CD13+、CD34+、CD117+（bright）预测 FLT3 突变;cluster2 的 15 例均为 MPAL,73.3%（11/15）伴有 CEBPA突变。以上结果提示伴有FLT3突变和CEBPA突变的T/M急性白血病可能是两种新的疾病亚型。6.通过表达谱和突变谱特征综合分析,可以将89例MPAL分为8个组:G1-G8,其中42例G1-G4组中41例（97.6%）免疫表型为T/M和B/T,仅1例（2.4%）为B/M,47例G5-G8组中44例（93.6%）免疫表型为B/M,仅3例（6.4%）为T/M。临床及实验室特征分析显示,G1组血小板计数低,66.7%的患者为正常核型;G2组中位白细胞计数低,80.0%的患者为正常核型;G3组多伴高原始细胞计数及复杂核型;G5和G8组t（9;22）/BCR-ABL1检出率高,均以P210为主。形态学方面基于FAB分型,G1组多表现为M1/M2,以髓系特征为主;G5和G6组多表现为M4/M5,以髓系单核系特征为主;G7组多表现为ALL/M0,以淋系特征为主。突变谱分析显示,G1组均检出CEBPA突变,对应cluster2;G2组以NOTCH1和DNMT3A突变为主;G3组以NOTCH1、JAK3和PHF6突变为主;G4组以FLT3突变为主,对应cluster1,并伴BCL11B和KIT基因高表达,推测可以用FLT3抑制剂靶向药物治疗;G8组以RUNX1突变为主。基因集富集分析显示,G5与G6组富集通路相似,均显著富集髓系发育通路、NPM1突变相关通路、MLL重排相关通路及NF-kB信号通路相关基因,推测可以用MENIN-MLL抑制剂及NF-kB信号通路抑制剂靶向治疗;G7与G8组富集通路相似,均显著富集B淋系祖细胞通路及BCR-ABL1通路相关基因。7.基于基因组学和转录组学的分析,我们建议在2016 WHO已有分型的基础上,纳入新的关键基因,细化原有分型,新增五种亚型包括:MPAL伴Ph-like、MPAL伴KMT2A-r-like、T/My MPAL伴CEBPA基因突变、T/My MPAL伴NOTCH1基因突变、T/My MPAL伴BCL11B高表达及FLT3基因突变,同时将Ph+MPAL细分为Ph+伴髓系特征和Ph+伴淋系特征;T/My MPAL伴NOTCH1基因突变细分为NOTCH1协同DNMT3A突变和NOTCH1协同JAK3和PHF6突变。我们推测不同亚型可以采用化疗方案联合靶向药物治疗,比如KMT2A-r-like组联合应用MENIN-MLL抑制剂,FLT3基因突变组联合应用FLT3抑制剂。结论:1.MPAL是一类高度异质性疾病,不同亚型具有不同的突变谱和表达谱特征。T/My以CEBPA、NOTCH1、DNMT3A基因突变及上调T细胞受体信号通路相关基因表达为特征,Ph+以RUNX1突变、拷贝数缺失及上调BCR-ABL1下游信号通路为特征,B/My组主要上调PI3K-Akt信号通路相关基因表达,B/T主要表现为NOTCH1和PHF6基因突变。2.基于基因组学及转录组学特征可以将MPAL分成8个亚组,每组具有独特的突变谱及表达谱特征,8组的主要特征分别为:G1组特征为CEBPA突变,G2组特征为NOTCH1突变协同DNMT3A突变,G3组特征为NOTCH1突变协同JAK3和PHF6突变,G4组特征为BCL11B高表达伴FLT3突变,G5组特征为Ph+伴髓系特征,G6组特征为KMT2A-r/KMT2A-r-like,G7组特征为Ph-like,G8组特征为Ph+伴淋系特征。本研究为实现MPAL的精准分子分型、开展前瞻性临床试验及靶向治疗提供了理论依据。三、混合表型急性白血病异质性群体的初步研究目的:初步探讨MPAL免疫表型异质性群体的特点及驱动不同系列分化可能的影响因素。方法:1.筛选免疫表型为双系列表型且有足够骨髓冻存样本的MPAL病例,通过流式细胞仪分选骨髓样本的不同亚群,包括髓系白血病细胞亚群（My-blast）、淋系白血病细胞亚群（B-blast或T-blast）及正常T细胞亚群（Tcells,作为正常对照）,利用全外显子测序技术检测不同亚群的基因组变异情况。2.利用单细胞转录组测序技术从单细胞水平上探讨MPAL不同亚型（Ph+与T/My）细胞群体的特点及驱动向不同系列分化可能的影响因素。结果:1.本研究共筛选到7例MPAL样本,包括4例Ph+及3例T/My,其中4例Ph+免疫表型均为B/M。流式分选亚群进行全外显子测序后共检测到156个突变位点,包括82个SNVs及74个 indels。血液肿瘤常见基因突变如 PHF6、RUNX1、NOTCH1、PTPN11、NRAS、EZH2、JAK3等在髓系白血病细胞亚群和淋系白血病细胞亚群均检出,提示MPAL样本内免疫表型的异质性特征可能不是由基因组变异导致的。其中最常见的基因突变是PHF6和RUNX1,变异等位基因频率（VAF）比例高,提示PHF6和RUNX1等转录因子相关突变是主要克隆,可能出现在疾病早期,而与信号通路相关突变如NOTCH1、NRAS、KRAS等VAF比例低,可能是次要事件。2.利用语义索引聚类方法分析单细胞转录组测序数据,通过与文献中正常对照样本对比分析,将每例MPAL的细胞分为disease-like和healthy-like,并将disease-like的不同亚群分为HSC-like、CLP-like、CMP-like、GMP-like、Early erythroid-like、monocyte-like、DC-like、Pre-B-like、B-like及T-like,结果显示MPAL病例中均以前体细胞增殖为主。值得注意的是,Ph+组中monocyte-like 和 DC-like 比例明显高于 T/My 组（7.96%vs 0.04%,P＜0.0001;11.37%vs 1.24%,P＜0.0001）,并且3例伴有RUNX1突变的Ph+MPAL中pDC-like的比例明显高于1例RUNX1野生型的Ph+MPAL。同时,我们在一例伴有RUNX1突变的Ph+病例的三个细胞中检出了 RUNX1突变,两个细胞是pDC-like,一个细胞是GMP-like,提示pDC-like可能起源于白血病细胞,需要进一步扩大样本验证,RUNX1突变在pDC增多的Ph+MPAL发病中的作用机制也值得进一步研究。3.通过筛选淋系亚群和髓系亚群的差异基因以及蛋白互作分析,我们推测T/My组MSI2、DNTT及LGALS1、PLEK分别在T淋系和髓系分化过程中扮演一定角色,而Ph+组转录调节因子TCF4通过与TCF12及EBF1互作在B淋系分化中发挥潜在作用,PLEK通过与ITGB2互作在髓系分化中发挥潜在作用。结论:1.MPAL样本内免疫表型的异质性特征不是由基因组变异导致的,可能与肿瘤细胞的起源有关;转录因子相关基因突变发生在疾病早期,提示在MPAL发病机制中发挥关键作用。2.单细胞转录组测序结果显示Ph+组和T/My组的细胞亚群比例有所差异,其中Ph+组monocyte-like和DC-like亚群比例明显高于T/My组,而且在pDC-like细胞中检测到RUNX1突变,提示RUNX1突变可能在伴pDC增多的Ph+ MPAL中发挥潜在作用。3.MPAL中不同转录因子的表达在肿瘤细胞向不同系列分化中发挥重要作用。