目的:本研究采用细胞生物学试验观察、网络药理学分析寻找、细胞蛋白质组学筛选、蛋白印迹法检测和整体动物试验验证,探寻巴西甘菊花中抗结肠癌作用的活性单体成分及其作用机制。方法:①MTT法探寻巴西甘菊花中抗结肠癌活性单体成分:巴西甘菊花经化学提取、分离和纯化研究,获得6个含量较多的单体成分,采用MTT法观察单体成分对结肠癌细胞HT-29增殖情况,获取具有抗结肠癌活性的单体作为研究对象。②细胞生物学试验观察确定坡模酸(PA)及其吡喃葡萄糖酯(PAO)的抗结肠癌作用:采用MTT法检测PA抗HT-29细胞增殖情况,倒置显微镜下观察细胞形态变化,细胞计数仪直接读取HT-29细胞存活率;采用Honest 33342染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI流式细胞术观察细胞凋亡情况,PI单染流式细胞术测定细胞周期变化;采用划痕试验观察HT-29细胞迁移情况。③网络药理学分析寻找PA和PAO的作用靶点:利用大数据平台收集PA和PAO潜在作用的靶点以及筛选结肠癌疾病靶点,并将两者预测靶点进行交集,建立预测靶点蛋白相互作用网络;采用富集分析得到靶点生物学功能以及涉及通路情况,最后将PA和PAO分子与核心靶点进行对接来初步确定寻找到的作用靶点。④细胞蛋白质组学探讨PA和PAO可能作用靶点:通过细胞蛋白提取、烷基化、酶解、脱盐、LC-MS上样和差异蛋白初筛等处理,得到差异蛋白,并对差异蛋白进行生物学功能分析和通路分析,最后筛选出与癌症、细胞凋亡和周期相关的差异蛋白。⑤蛋白印迹法检测验证:综合上述体外细胞实验、网络药理学以及蛋白质组学试验结果,采用蛋白印迹法检测PA和PAO对蛋白Bax、Bc12、Caspase 3、Jak1、Stat3、p-stat3和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的蛋白相对表达量。⑥整体动物试验验证:采用结肠癌HT-29细胞混悬液皮下注射裸鼠右前肢成瘤作为瘤源,取第二代瘤源进行瘤块接种从而构建异种异位移植瘤模型,第二代肿块接种后第三天开始灌胃给药,每天一次,连续给药21天后,颈椎脱臼处死动物,测定肿瘤体积和肿瘤重量,取肿瘤组织、肝脏组织HE染色,观察其病理变化情况。结果:①从巴西甘菊花分离出的单体成分坡模酸、1-(2-甲基丁酮)-3-异戊烯-间苯三酚、熊果酸和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷在实验浓度下对HT-29细胞增殖有抑制作用,其中PA抗结肠癌细胞增殖作用最强。②PA和PAO均能呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖;与对照组相比,给药组HT-29细胞密度更稀疏,排列不紧凑,细胞体型更细长;PA组细胞存活率显著降低;PA和PAO均能显著促进HT-29细胞凋亡,并使HT-29细胞大量阻滞于G0/G1期;均能显著降低细胞迁移率。③网络药理学分析显示PA和PAO的核心靶点分别为ERBB2、PPARG、PTGS2和TNF;MAPK3、STAT3和MTOR,进一步经对接结果显示,PA能与ERBB2、PTGS2、TNF稳定结合;PAO与MAPK3和STAT3稳定结合。初步说明ERBB2、PPARG、PTGS2和TNF;MAPK3、STAT3分别为上述物质作用靶点。④蛋白质组学研究显示PA和PAO作用HT-29细胞后,PA共得到1 1个差异蛋白,其中上调蛋白6个,下调蛋白5个。PAO组得到13个差异蛋白,其中上调蛋白为1个,下调蛋白为12个。两者表达一致的蛋白共有5个,分别为GSTP1、MCM7、mTOR、TAB2和XPO1。这些靶点分别涉及mTOR、自噬相关、细胞周期等信号通路。⑤蛋白印迹实验显示,PA能升高Bax/Bcl2比值,上调Caspase3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白相对表达量;对蛋白Jak1表达量无影响,下调Stat3蛋白表达,但无统计学差异,下调p-stat3蛋白相对表达量。PAO亦能升高Bax/Bcl2比值,上调p62蛋白相对表达量;上调Jak1蛋白表达量,下调Stat3、p-stat3蛋白相对表达量。⑥整体动物实验显示,PA和PAO组能显著抑制移植瘤的体积和重量,但不影响瘤重指数和脾脏指数;HE染色显示PA和PAO组肿瘤组织核分裂更不活跃,且存在较多的坏死、肉芽组织和纤维化等炎性改变,但这些病理学结果均无统计学差异。肝组织病理显示均未见模型组和受试药组发生肿瘤肝转移。结论:PA为巴西甘菊花中抗结肠癌细胞增殖的最强的单体成分之一,其抗结肠癌的作用机制可能与上调Bax/Bcl2、Caspase 3的蛋白相对表达量,导致细胞凋亡;上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白相对表达量,促进自噬的发生从而导致细胞死亡有关;PAO抗结肠癌的作用机制与增加Bax/Bcl2、下调Stat3蛋白相对表达量有关。