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目的益生菌是指定植于人体内并对人体产生有益作用的活性微生物。当前研究较多的益生菌制剂为作用于肠道微生态系统,并且在肠道中发挥有益作用的双歧杆菌,嗜热链球菌等菌株。但是对作用于呼吸道微生态系统,在呼吸道中发挥有益作用的益生菌研究较少。甲型链球菌作为人体口咽部的正常菌群,相关研究显示使用含有甲型链球菌株的益生菌制剂协同其它药物来治疗呼吸道感染性疾病相较于单纯使用抗生素有着更好的疗效。本课题组在健康儿童口咽部分离得到对多种致病菌株存在拮抗作用的两株链球菌菌株4-2、4-19。本研究针对两株链球菌的种属名称及分类学地位进行鉴定,同时对使用时的安全性进行评价。方法(1)使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌株4-2、4-19基因组进行提取,通过PCR扩增出其16S rRNA基因片段、保守基因片段,通过测序得到两菌株16S rRNA基因、保守基因序列。使用GenBank数据库对两菌株16S rRNA基因序列进行比对。将两菌株完整基因组进行全基因测序。同时对菌株的菌落形态,镜下形态,生化等特征进行检测。(2)对实验动物进行经口给药为期7天急性毒性实验(多剂量毒性研究)和为期28天的亚急性毒性实验(多剂量毒性研究)。在试验期间对实验动物的体重、采食量进行监测,在试验结束后对实验动物血液测定血常规,采集实验动物咽拭子进行高通量测序。对主要脏器进行病理组织学检查。同时测定两菌株对链球菌属常用的多种抗生素的敏感性。结果(1)通过对16S rRNA基因测序结果的比对,两株菌结果相似,都属于链球菌属内的缓征群。两株菌都与Streptococcus oralis subsp.dentisani strain 7747相似度最高,Per.Ident值为99.03%,同时与缓征群内Streptococcus pseudopneumoniae strain 108、Streptococcus mitis strain ATCC 49456、Streptococcus mitis strain NS51、Streptococcus mitis strain ATCC 49456、Streptococcus pneumoniae strain NBRC 102642、Streptococcus pneumoniae strain ATCC 33400,Per.Ident值均大于98%。16S rRNA基因与保守基因进化发生树的分析结果也验证了这一结果,同时确定Streptococcus pneumoniae ATCC 33400,Streptococcus pseudopneumoniae ATCC BAA-960,Streptococcus oralis ATCC 35037,Streptococcus mitis ATCC 49456,Streptococcus dentisani DSM 27089为4-2、4-19的邻近菌株。培养后可以观察到两菌株均为圆形隆起,白色,针尖大小有α溶血现象的细小菌落。光镜和电镜下可见到典型的链球菌形态。生化、脂肪酸结果显示菌株4-19与其临近菌株存在不同程度的差异。通过对全基因组测序结果进行DDH杂交结果显示菌株4-2与4-19值达到99.6%远远高于70%的临界值。而4-19与链球菌属缓征群内其他链球菌值均小于70%。(2)急性和亚急性毒性试验在采食量、体重和相对器官重量中均未发现各剂量组与对照组出现显著性的降低。在亚急性毒性试验中血常规各项目在剂量组和对照组之间差异没有显著性变化。在病理学检查中高剂量组雄性动物各脏器均未发现坏死、纤维化、炎细胞浸润、正常结构缺失和萎缩现象。高通量测序结果中发现,给予4-19的高剂量组雄性组相较于对照组放线菌门明显增加,变形菌门明显减少。药敏试验中菌株4-19对链球菌常用的10种抗生素均敏感。结论(1)研究结果表明菌株4-2、4-19与现知的链球菌均不相同。是一个未被报道过的链球菌属内的新种。我们将其命名为streptococcus shenyangsis sp.nov。(2)在急性和亚急性毒性试验中,给予实验动物口服两菌株是安全的。