乳腺癌目前是全世界第二大恶性肿瘤,大约每年有140万新发患者。在全部癌症患者中,乳腺癌约占23%,其中女性癌症相关死亡患者中占15%,成为最为致命的疾病之一。传统的肿瘤治疗模式例如手术、化疗、放疗以及靶向治疗都是乳腺癌治疗的有效手段,尤其术后辅助化疗对提高患者生存率意义重大。但由于多药耐药性,选择性缺乏以及快速的药物清除率以及药物对正常细胞的杀伤,降低了化疗药物对肿瘤细胞的治疗作用。多柔比星(阿霉素DOX),是一种重要的蒽环类衍生物,具有广泛的抗肿瘤谱,在临床上应用于包括乳腺癌在内的多种肿瘤的治疗。表柔比星能够插入肿瘤细胞DNA,干扰复制和转录进程,进而导致肿瘤凋亡,在各个生长周期均能起到杀灭作用,属于非周期特异性抗肿瘤药物。但其抗肿瘤作用受到机体快速清除作用影响,选择特异性差,同时具有较严重的毒副作用(如心脏毒性),在临床应用时受到诸多限制。选择性的靶向化疗药物通过载体递送系统(CDDS)向肿瘤组织特异性释放化疗药物,在肿瘤治疗中具有巨大的应用前景。磁性纳米粒子(MNP)可以在磁性环境下选择性定位肿瘤组织,近年来越来越受到关注。通常聚合物覆盖于纳米粒子后能够表现出包括低毒性,生物相容性,生物降解及细胞粘附等多种特性。并且,聚合物能够防止药物的突释现象,达到药物持续稳定作用。本实验着眼于制备搭载多柔比星的磁性纳米粒子(DOX-CMMN),研究其特性及对MCF-7乳腺癌细胞的抗癌活性。纳米粒子的壳聚糖护层能够保护药物的释放过程,提高磁性系统的生物相容性。我们通过化学及热力学方法基于Fe3O4构建介孔磁性纳米粒子,将多柔比星搭载于纳米粒子的介孔中,然后后表面覆盖壳聚糖形成复合物。DOX-CMMN在交流磁场环境下能够选择性到达肿瘤位置,通过热效应促使药物释放,并且经由热疗效应加速肿瘤细胞凋亡。实验结果如下：1、搭载多柔比星的磁性纳米粒子(DOX-CMMN)的建立材料及方法FeCl3·6H20和FeCl2·4H20以2：1的比例混合后,按1g：25ml加入乙二醇。混合物于80℃加入2g乙酸钠和5ml乙二胺,温度升至180℃左右持续反应,然后冷却。后在磁场作用下将磁性纳米粒子分离出来后用乙醇和水冲洗。100mg MMN微粒溶液内加入5ml多柔比星溶液(15%),室温下冷却1小时,经超声处理20分钟将药物分散开。100 mg的DOX-MMN溶于司盘80乳化剂的水溶液中,加入30ml 1%壳聚糖溶液,在磁场环境下持续搅拌3h。然后于超声水浴下混合60分钟。在磁场作用下将CMMN分离。CMMN的药物包封率(DE%)通过分光仪测定：DOX-CMMN在15000rpm下离心15分钟,收集上清液使用紫外可见光谱仪480nm波长测定含药量。通过公式计算CMMN多柔比星载药量及搭载率。样本在25℃,每份标本分三份,使用粒度仪采用动态光散射技术测量微粒平均直径和粒径分布。采用扫描电子显微镜(SEM)观察微粒形态及表面结构。采用磁力计测定MMN及CMMN的磁性。使用分光光度法测量盐酸多柔比星(DOX)溶液在200～500nm范围的紫外-可见吸收光谱,可以看到在480nm左右为吸收峰,确定480nm作为多柔比星的测定波长。配制标准浓度分别为0.2mg/ml,0.4 mg/ml,0.6 mg/ml,0.8 mg/ml, lmg/ml的DOX溶液,测量在480nm波长的吸收值,绘制多柔比星标准吸收曲线。研究在磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH7.4)和醋酸盐缓冲盐水(ABS, pH5.5)中磁性纳米粒子搭载的多柔比星的释放:DOX-CMMN稀释于1ML的PBS溶液后放入透析袋,将透析袋放入盛有25ml PBS溶液的试管内,37℃震动水浴箱中,于1h,2h,4h,8h,12h,16h,24h,36h,48h间隔时间,取出1ml透析液,使用光谱仪测定480nm波长吸光度,计算DOX含量,测试完成后将取出液倒回透析液中。使用分光光度法测量释放出的药物量,取均数±标准差,描绘时间药量图。结果：应用热溶剂法制备磁性纳米粒子,将多柔比星与介孔磁性纳米粒子在室温下共同孵育,使药物搭载于纳米离子介孔中。最后将壳聚糖被覆于CMMN表面。由于其具有的多孔性和水相可分散性,CMMN呈现出很高的多柔比星搭载性能,实验显示包封率90.4%,载药量约19%。高效率的活性药物搭载率可能与多柔比星的亲水性以及所含的NH：,+基团有关。药物表面的正电荷被MMN表面负电荷所吸引,MMN表面的多孔性促进了药物的搭载。粒度仪结果显示DOX-CMMN颗粒直径平均在120nm,纳米粒子的多分散系数在0.2左右,构建机制较为理想。D0X-CMMN微粒的扫描电镜图像显示微粒体表面光滑,呈规则的球形,部分区域可见团块聚集,考虑为粒子表面强效的磁偶极子间相互作用形成聚集,电镜下测量的粒子直径,大小约120nm,与之前在水溶状态下使用光散射法测定的数据一致。CMMN粒子和MMN粒子均表现出超顺磁性的特征,CMMN粒子的磁饱和性较后者稍低,证磁性的轻度减弱源于表面覆盖的壳聚糖,这些聚合物可能会减少MMN表面的磁死层。不同浓度的多柔比星溶液在480nm波长的吸收值为3.7069,7.1951,10.6403,14.5028,17.1009(1/trans),浓度与吸光度呈良好线性相关,回归方程式Y=17.0618X+0.4611,相关系数R2=0.9981。体外DOX-CMMN微粒释放实验中,在两种酸碱度不同的溶液中,时间间隔1h,2h,4h,8h,12h,16h,24h,36h,48h时的药物累积释放度,取均数±标准差,单因素方差分析,P<0.001,两组数据存在显著差异。pH7.7的PBS的溶液中释放率分别为2.38±0.21：3.67±0.37：6.24±1.37：10.09±1.74：16.35±2.02：24.95±3.02：38.16±3.94：51.74±3.49：58.16±4.86。pH5.5的ABS溶液中释放率分别为4.04±0.34；5.41±0.42；10.82±1.28；16.33±2.01；27.70±3.39；38.53±4.95；55.17±4.90；80.73±3.31；94.67±3.39。CMMN粒子在两种酸碱环境下均可以稳定释放,在酸性环境下(pH5.5)释放量更高。经过24h,pH7.4的溶液环境下,多柔比星的释放量达到38.16%,而pH5.5的环境下,多柔比星的释放量为55.17%。经过48h,pH7.4的溶液环境下,多柔比星的释放量达到58.16%,而酸性环境下多柔比星释放达到94.67%。2、DOX-CMMN微粒介导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的研究材料及方法从液氮中取MCF-7乳腺癌细胞,复苏后,加入RPMI1640培养基,于37℃,5%C02恒温湿度培养箱中培养。选用对数生长细胞以密度1×104/100 μl种植于96孔微孔板中。使用培养基加入空白CMMN粒子,配制浓度为0.001,0.01,0.1,0.5,1,5,10,50,100,200μg/ml的溶液。作用于MCF-7细胞24h,使用MTT比色法测定细胞活性率研究空白CMMN微粒的生物相容性。MCF-7细胞分别与DOX和D0X-CMMN微粒共同培养来研究其细胞毒性作用。实验分为三组,DOX组(n=42),DOX-CMMN组(n=42),和对照细胞组。浓度为0.001,0.01,0.1,0.5,1,5,10μg/ml的DOX-CMMN及DOX与MCF-7细胞共同孵育24h后,用PBS溶液清洗微孔板2遍,然后使用100μg MTT处理后继续孵育3h。抽去孔内培养液,加入150微克二甲基亚砜,使用酶标仪检测各孔的570nm的吸光度。所有的实验均重复6次。对应的培养液与细胞孵育后,PBS清洗,4%多聚甲醛固定后于电镜下观察。检测交流磁场环境对于药物作用的MCF-7细胞是否有增效作用。1×104MCF-7细胞与DOX、DOX-CMMN共同孵化6小时。将培养板分为两组,其中1组以保鲜膜覆盖保持无菌,于交流磁场下暴露5分钟、10分钟。然后继续放入恒温孵育箱培养。同样使用MTT方法,酶标仪检测各孔的570nm吸光度。所有的实验重复6次。结果体外环境下,不同浓度空白CMMN微粒作用后细胞活性率分别为99.81±7.14；99.70±4.33；99.83±3.62；99.23±3.31；99.03±4.30；99.83±6.51；96.53±7.20；94.39±3.47；87.22±5.59；85.01±4.80最大浓度200 μg/m1空白对照纳米粒子无明显的细胞毒性。所有的浓度细胞存活率均在85%以上,提示组织相容性非常好。微粒表面的壳聚糖是保证递送系统中微粒无细胞毒性作用的重要原因。DOX及DOX-CMMN微粒的细胞毒性测定实验,两组均呈现出剂量相关性细胞毒性作用。DOX-CMMN的细胞杀伤力更强。这种毒性作用的增强考虑与肿瘤细胞对纳米粒子药物的高摄取率有关。多柔比星组的IC50(半抑制浓度)大约为2.76μg/ml,而磁性纳米粒子的IC50大约为1.25μg/ml。通过MCF-7细胞的形态学成像,结果与细胞毒性检测结果相符合,对照组细胞表现为正常未处理细胞的形态。而DOX-CMMN作用的细胞显示出完全异型性及球形变。在交流磁场作用下,化疗药物与热力效应作用于MCF-7细胞的存在协同效应。DOX-CMMN作用于MCF-7细胞,对照组多柔比星组。同时置于交流磁场下的热力作用。D0X组细胞死亡率约30%,在交流磁场环境下细胞杀伤率有轻微增长。而DOX-CMMN组作用下细胞死亡率约40%,在交流磁场下5分钟,细胞死亡率65%,10分钟进一步增长到90%。结论成功制备搭载多柔比星的壳聚糖被覆磁性纳米粒子(DOX-CMMN)制备并检测其特性,DOX-CMMN的药物释放表现出可控性和持续性的特点,无爆发式释放的现象。DOX-CMMN具有剂量相关性抗肿瘤细胞增殖作用,在交流磁场作用下这种作用会增强。空白搭载纳米粒子在最大85%的浓度下,仍具有良好的生物相容性。我们的实验显示,壳聚糖被覆磁性纳米微粒递送系统在乳腺癌的靶向治疗中具有广阔的应用前景,在震荡磁场作用下能够靶向定位肿瘤组织,同时协同药物化疗及热力用,显著提高了抗癌活性。但目前尚缺少体内实验的数据,需进一步的研究该药物递送系统的治疗潜力。