背景动脉粥样硬化(AS)是一种缓慢进行性疾病,它是多种心脑血管疾病的主要病因,主要累及大中动脉。大量研究证明,血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管外膜成纤维细胞均与血管重构密切相关。原来主要是把血管内皮细胞、平滑肌细胞作为研究的重点,目前大量研究表明血管外膜细胞可以对很多刺激做出应答反应。血管外膜细胞被激活后具有增殖、迁移、表型转化、粘附、凋亡、分泌细胞因子和合成细胞外基质的能力。最近发现血管外膜含有较多的祖细胞,不论是在体内还是在体外都能够分化为血管平滑肌细胞,越来越多的证据表明血管外膜成纤维细胞(AF)在血管的增殖性病变中具有重要地位。这些提示动脉外膜在AS发病中的作用不容忽视。成纤维细胞特异蛋白(FSP1)为成纤维细胞分泌的细胞因子,大量研究表明,FSP1对维持细胞的生物学功能起着重要作用。然而FSP1对于AF细胞的具体作用机制尚不清楚。研究表明,FSP1可以介导多种信号通路参与生物活动。然而在AF细胞中,FSP1是通过何种信号通路参与细胞的生物功能(如细胞增殖、迁移、粘附、凋亡),仍然不清楚。综上所述,我们提出这样的的设想:FSP1可能激活影响AF细胞增殖的信号转导网络,从而整合和调控AF细胞的生物功能。本研究正是根据以上思路,设计体外试验以验证这一假说。目的1.探究FSP1、siRNA-FSP1对AF细胞增殖、迁移、粘附及凋亡的影响。2.探究FSP1调节AF细胞生物功能的分子机制。3.探究FSP1诱导下对AF细胞分泌炎性因子的影响。方法1.细胞培养:剥离小鼠的胸主动脉外膜组织,根据组织贴块方法进行原代细胞的培养,当细胞达到80-90%的融合时进行传代,本实验采用第4-8代细胞。分别用α-actin单抗(1:200)和波形蛋白(Vimentin)单抗(1:200)和二抗 TRITC(1:100)进行免疫细胞化学染色,鉴定所培养的细胞是否是所需要的AF及其纯度。2.实验分组:根据加入刺激的不同,实验共分为AF组(未处理组)、siContro1组(siRNA阴性对照组)、siRNA-FSP1 组、FSP1+siRNA-FSP1 组、FSP1 组、FSP1+AG490(JAK/STAT 阻断剂)、FSP1+DKK(Wnt 阻断剂)、FSP1+FPS-ZM1(RAGE 阻断剂)、FSP1+Stattic(JAK/STAT 阻断剂)。3.MTT与EdU实验:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,AF细胞经过48小时刺激后的增殖能力。4.划痕法检测细胞迁移距离:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,AF细胞在不同时间点的迁移能力。对每个培养板随机观察3个“窗口”,取其迁移面积的平均值。5.粘附实验:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,不同组的AF细胞的粘附能力。6.流式细胞仪分析:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,AF细胞经过48小时刺激后,不同分组中细胞周期分布和细胞凋亡率的变化。7.蛋白印迹分析:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,FSP1、RAGE、JAK2/STAT3、Wnt3a/β-catenin 信号通路蛋白以及某些炎性因子(MCP-1、VCAM-1、ICAM-1)的表达;观察AF(正常组)、siRNA-FSP1及FSP1三组中细胞周期相关因子(CDK4、Cyclin-D1、P53)的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。8.RT-qPCR 检测:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,FSP1、RAGE、JAK2/STAT3、Wnt3a/β-catenin 的 mRNA 表达。表达强弱用相应细胞因子的mRNA与β-actin条带积分光密度的比值表示。9.细胞免疫荧光染色:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,利用细胞免疫荧光检测FSP1、RAGE、JAK2/STAT3、Wnt3a/β-catenin信号通路蛋白在AF细胞中的表达。用IOD比较它们在不同分组间表达的强弱。结果1.AF的孵育和鉴定:组织贴块法培养血管外膜细胞,大约4天后会有细胞从组织块的边缘游离出、贴壁生长。10%FBS的DMEM中培养8-9天后出现第一次细胞融合。当细胞出现80-90%融合时进行传代,第4-8代用于实验。经免疫细胞化学法显示所有培养细胞的α-actin单抗染色阴性,所有培养细胞的波形蛋白(Vimentin)单抗染色阳性,说明培养的AF纯度达到100%。2.FSP1、siRNA-FSP1以及信号通路阻断剂对AF增殖的影响(1)FSP1影响AF细胞增殖呈剂量依赖性:MTT显示随着FSP1浓度的增加,AF细胞的增殖能力逐渐增强;随着siRNA-FSP1浓度的增加,AF细胞的增殖能力逐渐减弱。(2)MTT与EdU显示FSP1组的细胞增殖率明显高于AF、siRNA-FSP1以及siContro1 组;加入信号通路阻断剂后(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic),与FSP1组相比,细胞增殖率明显降低。3.FSP1、siRNA-FSP1以及信号通路阻断剂对AF迁移的影响(1)划痕实验显示FSP1组的愈合面积高于siRNA-FSP1、AF、siControl以及FSP1+siRNA-FSP1 组。(2)加入信号通路阻断剂后,与FSP1组相比,愈合面积明显降低。4.FSP1、siRNA-FSP1以及信号通路阻断剂对AF细胞粘附能力的影响(1)细胞粘附实验显示FSP1组的细胞粘附能力明显高于AF、siContro1、siRNA-FSP1 以及 FSP1+siRNA-FSP1 组。(2)加入信号通路阻断剂后,与FSP1组比较,细胞粘附能力明显降低。5.FSP1、siRNA-FSP1以及信号通路阻断剂对AF细胞周期和凋亡的影响(1)细胞周期及凋亡检测显示FSP1组处于S期的细胞比例明显高于AF、siControl、siRNA-FSP1以及FSP1+siRNA-FSP1组,然而凋亡期的细胞比例明显降低。(2)加入信号通路阻断剂后,与FSP1组比较,处于S期的细胞比例明显降低,而阻断剂组的AF细胞凋亡比例明显增加。6.Western blot 分析(1)FSP1 组的信号通路蛋白(RAGE、FSP1、p-JAK2、p-STAT3、Wnt3a、p-β-catenin)高于其他任何组。无论加入何种信号通路阻断剂后,此三条通路的相应磷酸化蛋白均表达减少。(2)加入FSP1刺激后,炎性因子(MCP-1、VCAM-1、ICAM-1)表达明显高于其他任何组。加入信号通路阻断剂后,这三种炎性因子的表达较FSP1组明显减少。(3)在AF正常组、siRNA-FSP1及FSP1三组中,FSP1与AF组比较,FSP1组的细胞周期相关蛋白Cyclin-D1、CDK4表达增加,P53表达减少;siRNA-FSP1组与AF组比较,siRNA-FSP1组的细胞周期相关蛋白Cyclin-D1、CDK4表达减少,P53表达增加。7.RT-qPCR 分析(1)FSP1 组 RAGE、FSP1、JAK2、STAT3、Wnt3a 以及 β-catenin 相应的 mRNA表达明显高于 AF、siControl、siRNA-FSP1 以及 FSP1+siRNA-FSP1 组。(2)加入信号通路阻断剂后,与FSP1组比较,上述蛋白对应的mRNA表达明显降低。8.细胞免疫荧光分析(1)细胞免疫荧光显示 FSP1 组的 RAGE、FSP1、p-JAK2、p-STAT3、Wnt3a、β-catenin 荧光密度高于 AF、siControl、siRNA-FSP1 以及 FSP1+siRNA-FSP1组。(2)加入信号通路阻断剂后,与FSP1组相比,阻断剂组信号蛋白的荧光密度明显减弱。结论(1)FSP1通过调节细胞周期对AF细胞的增殖、迁移及粘附均具有促进作用,siRNA-FSP1能够有效地抑制AF增殖、迁移和粘附。(2)RAGE、JAK2/STAT3以及Wnt3a/β-catenin三条信号通路之间的调控网络共同参与FSP1在AF细胞中的作用。(3)在AF细胞中,FSP1促进炎性因子(MCP-1、VCAM-1以及ICAM-1)的表达,促进血管重构。背景动脉粥样硬化是一种复杂的多因素疾病,是急性心血管事件的主要病因。越来越多的研究表明自噬在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。大量研究表明,自噬是一把双刃剑,既可作为细胞生长抑制又可充当细胞生存保护者。自噬能够促进细胞的生存,但是过多的自噬导致细胞损伤以及凋亡增加。细胞自噬在维持心血管系统代谢方面起着重要作用,参与心肌缺血再灌注损伤,参与心力衰竭(heart failure,HF)以及动脉粥样硬化等的病理生理过程。FSP1作为成纤维细胞特异蛋白,可以通过调节细胞自噬参与多种疾病过程。了解FSP1在自噬调节中的作用可能为预防和治疗动脉粥样硬化疾病提供新的见解。既往研究表明血管外膜成纤维细胞参与动脉粥样硬化的发展。在成纤维细胞中,胶原蛋白合成与自噬过程密切相关。然而FSP1在AF细胞中是否参与自噬,以及其具体作用机制尚不清楚;自噬与胶原蛋白之间存在何种关系仍然不明确。本研究正是根据以上思路,设计体外试验:在AF细胞中,研究FSP1是否参与自噬,进一步探究FSP1介导自噬可能相关的机制,最后探讨自噬与胶原蛋白之间的关系。目的1.观察FSP1、siRNA-FSP1在AF细胞中对自噬小体的影响;2.研究FSP1、siRNA-FSP1及信号通路阻断剂对相关自噬蛋白的影响;3.研究FSP1在AF细胞中介导自噬的相关机制;4.探究在FSP1刺激下,自噬与胶原蛋白之间的关系。方法1.细胞培养:剥脱小鼠胸主动脉的外膜,根据组织贴块法进行原代细胞的培养,当细胞达到80-90%的融合时进行传代,本实验采用第4-8代细胞。2.透射电镜检测细胞自噬:观察FSP1、siRNA-FSP1干预后,不同组中细胞自噬小体的变化。3.蛋白印迹分析:(1)观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,相关自噬蛋白(LC3B、Beclin-1、Apg7、p62)的表达;强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。(2)检测 AF、siRNA-FSP1 组、FSP1 组的 LC3、p-β-catenin、p-JAK2、p-STAT3、RAGE的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。(3)检测 AF、FSP1 组、FSP1+cardamonin(β-catenin 阻断剂)组的 LC3、p-β-catenin的表达;检测 AF、FSP1 组、FSP1+FPS-ZM1(RAGE 阻断剂)组的 LC3、RAGE的表达;检测 AF、FSP1 组、FSP1+AG490(JAK2/STAT3 阻断剂)组的 LC3、p-JAK2、p-STAT3的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。(4)检测 AF、siRNA-FSP1 组、FSP1 组的 LC3、p-JNK、p-ERK、p-p38、RAGE的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。(5)检测 AF、FSP1 组、FSP1+SP600125(JNK 阻断剂)组的 LC3、p-JNK 的表达;检测 AF、FSP1 组、FSP1+PD184352(ERK 阻断剂)组的 LC3、p-ERK的表达;检测 AF、FSP1 组、FSP1+SB203580(P38 阻断剂)组的 LC3、p-P38的表达;强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。(6)检测AF、siRNA-FSP1以及FSP1三组的胶原蛋白及LC3B的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。4.细胞免疫荧光染色:观察 FSP1、siRNA-FSP1 以及信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,利用细胞免疫荧光检测LC3蛋白在AF细胞中的表达。用IOD比较它们在不同分组间表达的强弱。结果1.AF的孵育:组织贴块法培养血管外膜细胞,大约4天后会有细胞从组织块的边缘游离出、贴壁生长。10%FBS的DMEM中培养8-9天后出现第一次细胞融合。当细胞出现80-90%融合时进行传代,第4-8代用于实验。2.自噬检测透射电镜显示FSP1组的自噬小体明显高于AF、siContro1与siRNA-FSP1组。3.Western blot 分析(1)FSP1组的自噬相关蛋白(LC3B、Beclin-1、Apg7)的表达明显高于其他组;然而p62的表达呈现相反的结果。(2)FSP1 组的 LC3、p-β-catenin、p-JAK2、p-STAT3、RAGE 表达高于正常 AF组及 siRNA-FSP1 组。(3)FSP1 组的 p-β-catenin、LC3 表达高于正常 AF 组及 FSP1+cardamonin 组;FSP1 组的 p-JAK2、p-STAT3、LC3 表达高于正常 AF 组及 FSP1+AG490 组;FSP1组的RAGE、LC3表达高于AF组及FSP1+FPS-ZM1组。(4)FSP1 组的 LC3、p-JNK、p-P38、p-ERK 表达高于正常 AF 组及 siRNA-FSP1组。(5)FSP1 组的 p-JNK、LC3 表达高于正常 AF 组及 FSP1+SP600125 组;FSP1组的p-P38、LC3表达高于正常AF组及FSP1+SB203580组;FSP1组的p-ERK、LC3 表达高于 AF 组及 FSP1+PD184352 组。(6)AF、siRNA-FSP1以及FSP1三组中,FSP1组的胶原蛋白(I型和III型)明显高于AF及siRNA-FSP1组,LC3B表现出同样的趋势。4.细胞免疫荧光分析细胞免疫荧光显示FSP1组的LC3B荧光密度高于AF、siControl、siRNA-FSP1以及FSP1+siRNA-FSP1组,加入信号通路阻断剂(AG490、DKK、FPS-ZM1、Stattic)干预后,与FSP1组相比,LC3B的荧光密度明显降低。结论1.FSP1在AF细胞中促进自噬。2.FSP1通过RAGE、JAK2/STAT3以及Wnt3a/β-catenin信号转导通路交叉促进AF细胞的自噬。3.FSP1激活RAGE后进一步激活RAGE下游信号JNK/ERK/p38,诱导AF细胞自噬。4.AF细胞中,自噬增强后,胶原蛋白(Ⅰ型和III型)的合成同时增加。