神经细胞中的tau蛋白异常聚集是许多神经退行性疾病共有的病理特征,例如在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),进行性核上瘫(progressive supranuclear palsy)及第17号染色体异常导致的额颞叶型痴呆伴巴金森症(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17),这些疾病统称为tau蛋白病(tauopathy)。我们的前期研究发现,人类的泛素连接酶Hrd1和tau在AD病人的皮质和海马神经元内有共定位。且Hrd1的表达和异常磷酸化tau的聚集存在负相关。我们在细胞模型上观察到Hrd1的表达可以减少tau的毒性,并发现该作用与Hrd1能降低tau蛋白总体水平有关。在上述研究的基础上,本文进一步探讨了Hrd1减少细胞内tau蛋白水平的相关机制。这不仅有助于进一步认识Hrd1的功能和tau蛋白病的病理机制,也为以Hrd1为靶点的药物设计和筛选提供技术平台。目的:观察Hrd1能减少细胞内tau蛋白水平是否与其介导tau降解有关及其降解机制。方法:将pEGFP-C1-tau真核细胞表达质粒与野生型Hrd1或酶失活型Hrd1C1A转染293T细胞,然后用Western blot方法检测细胞内相关蛋白的水平;同时用GSK-3β诱导tau过度磷酸化,观察Hrd1过度磷酸化的tau降解的影响。用CHX示踪法观察蛋白质的降解;用免疫荧光双标及免疫沉淀法观察Hrd1和tau的相互作用。结果:1.Hrd1降低细胞内磷酸化及非磷酸化tau的水平采用非神经来源的293T细胞株,转染GFP-tau、wtHrd1和Hrd1C1A质粒,并用GSK-3β共转染细胞以诱导tau蛋白磷酸化。结果显示,转染后16-24 h,共转染Hrd1的细胞荧光减弱。Western blot结果显示:与单独转染tau质粒的细胞相比,共转染Hrd1的细胞内磷酸化及非磷酸化tau的水平都明显减少,而共转染Hrd1C1A则对细胞内tau的水平没有明显影响。提示,Hrd1能降低细胞内磷酸化及非磷酸化tau的总体水平,这可能是Hrd1减少tau毒性的原因。2.Hrd1促进tau蛋白的降解为了进一步观察tau蛋白的减少是否由于tau降解增加所致,我们在转染后24 h,在细胞的培养上清液中加入放线菌酮(CHX)以阻断tau的蛋白合成,并于加入CHX后4 h,8 h,16 h分别收取细胞,用免疫印记分析tau的水平。结果显示共转染Hrd1的细胞,tau蛋白的清除加快。表明Hrd1可以促进tau的降解。3.Hrd1促进磷酸化tau蛋白的降解年龄相关的NFTs的形成具有神经毒性,高度磷酸化的tau在这个过程中具有重要作用。以前的研究表明泛素连接酶CHIP可以识别磷酸化的tau蛋白,并且在tau蛋白上加上泛素。我们在293T细胞中共转染编码tau和GSK-3β的质粒来诱导tau的磷酸化。结果发现GSK-3β磷酸化后tau蛋白的总体水平提高。这个可能由于tau磷酸化后稳定性提高的缘故。当共转染Hrd1时,Hrd1降低了GSK-3β诱导的磷酸化tau的总量。CHX实验表明wtHrd1可以促进磷酸化tau蛋白的降解。这些结果表明Hrd1可以促进磷酸化tau蛋白的降解。4.蛋白酶体参与Hrd1介导的tau降解有报道显示,蛋白酶体可以降解tau蛋白。为了观察蛋白酶体是否参与了Hrd1介导的tau蛋白降解,我们在293T细胞内转染tau或共转染tau和Hrd1,在收取细胞前4 h,培养液内加入蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂氯化铵。结果表明,蛋白酶体抑制剂MG132可以稳定tau蛋白的表达,而氯化铵不能稳定tau的表达。当用N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)抑制去泛素化后,我们可以观察到高分子量tau的聚集,这些结果表明蛋白酶体参与了Hrd1介导的tau蛋白的降解。5.Hrd1与tau蛋白的相互作用我们以前的研究发现,Hrd1可加强胞质蛋白带有扩展型多聚谷氨酰胺Huntingtin的降解。Hrd1是否也可以与胞质蛋白tau相互作用呢?为了回答这个问题,我们首先进行了免疫共沉淀(IP)实验。在293T细胞内共转染tau和Hrd1的质粒,24h后收集细胞并裂解,然后用单克隆抗体tau-5进行免疫沉淀细胞裂解液中的tau蛋白,再用免疫印迹(IB)法检测Hrd1是否可以被tau共沉淀下来。结果发现,在IP tau时,同时把Hrd1共沉淀下来,而且这种作用是不依赖于Hrd1的E3活性的。同时,我们使用免疫荧光双标时发现,Hrd1与tau在细胞内有共定位。提示Hrd1与tau蛋白存在相互作用。6.Hrd1增强tau的泛素化为了更进一步确定Hrd1可以泛素化tau蛋白,我们在293T细胞内共转染编码Hrd1,His-tau,ubiquitin蛋白的质粒。蛋白酶体抑制剂MG132用来抑制泛素化tau的降解。我们发现Hrd1的过表达可以增加高分子量的tau,当用GFP-tau质粒转染细胞时,也得到了同样的结果。在免疫沉淀实验中,抑制蛋白酶体活性后,转染Hrd1质粒的细胞tau的泛素化明显增强。这些高分子量tau的形成与tau的泛素化有关。为了了解tau磷酸化对Hrd1介导的tau泛素化的影响,我们在293T细胞内共转染编码GSK-3β的质粒。结果发现,在共转染GSK-3β的细胞内,高分子量tau蛋白的量显著增加,提示GSK-3β诱导的磷酸化可以稳定泛素化的tau蛋白。结论:以上研究结果表明,Hrd1可以促进细胞内过度表达的磷酸化和非磷酸化tau的降解,这种作用依赖其E3活性;泛素-蛋白酶体通路参与了Hrd1介导的tau蛋白降解,这可能是Hrd1减轻tau毒性,保护细胞的原因之一。