第一部分：可激活免疫细胞靶向EGFR高表达肿瘤细胞重组蛋白的设计、表达及对肿瘤的治疗作用肿瘤靶向治疗是当前癌症治疗的研究热点,并代表未来发展的方向。而肿瘤免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗模式—肿瘤生物治疗,具有广阔的应用前景。有效地将两者结合起来是研发新型抗肿瘤药物的一大趋势。目前在抗肿瘤靶向药物的开发中,表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)是公认的、选用最多的靶向治疗靶点。现在临床上主要有两大类EGFR靶向的抗肿瘤药物：一,小分子酪氨酸激酶抑制剂(small-molecule tyrosine kinase inhibitors, TKIs);二,单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs)。但是在应用过程中发现有显著一部分患者对这两类药物均明显耐药,而最初敏感的患者在经过治疗后,转而发展为耐药,最终导致预后较差。通过分子水平的机制研究发现这种耐药多是由于EGFR激酶结构域存在突变,或其下游信号通路的持续活化造成。在这种情况下,肿瘤细胞不再依赖表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)结合EGFR的启动激活信号,却可以持续地生长增殖,肿瘤细胞呈自主性生长状态。因此针对EGF-EGFR信号不敏感的肿瘤细胞,需要新的治疗方法。本研究旨在开发能够靶向免疫治疗该类肿瘤的重组蛋白类药物,即新型的Biosimih ar。为充分调动机体的免疫系统,将抗肿瘤免疫治疗机制运用至新型药物中,本研究将显性抗原肽构建至重组蛋白,组成一个EGFR靶向的双功能重组免疫调节蛋白,用于高表达EGFR肿瘤的治疗。本研究采用EGFR的天然配体EGF作为靶向结合载体,将其与来自李斯特菌溶细胞素O (Listeriolysin O, LLO)的3个显性T细胞表位融合,通过序列拼接构建了重组融合蛋白pLLO-hEGF。人EGF是一个由53个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量小,与EGFR的亲和力高。而LLO是一个已经证实的强大的免疫原性分子,具有丰富的CD4+和CD8+T细胞抗原表位。本研究选用了经文献证实的2个CD4+和1个CD8+T细胞表位。所构建的重组蛋白pLLO-hEGF经生物信息学软件分析,理论分子量仅为16 kDa,性质稳定,血管穿透性将优于mAb。同时该重组蛋白应具有2种功能：既可以通过EGF靶向结合高表达EGFR肿瘤细胞,同时其LLO的显性抗原表位又可以充分活化机体的免疫细胞,使免疫细胞在肿瘤细胞部位聚集,从而加强攻击和杀伤肿瘤细胞,发挥靶向免疫治疗肿瘤的作用。我们首先采用生物工程的分子克隆技术以及蛋白表达纯化技术,成功克隆表达和获得了可溶性双功能重组蛋白pLLO-hEGF,4L重组菌液量可得(4.5-6)mL浓度为800 μg/mL左右(最大1.0 mg/m1)的纯化蛋白。接下来通过Western blot筛选了高表达EGFR的人肿瘤细胞系,从不同细胞系中各挑选出2种,包括人乳腺癌(MDA-MB-231、SK-BR-3)、人肺癌(A549、NCI-H157)和人结直肠癌(HCT116、HT-29),用于双功能重组蛋白pLLO-hEGF相关的功能研究。细胞免疫化学荧光染色实验结果显示了pLLO-hEGF可以很好地靶向结合这些肿瘤细胞表面。细胞增殖实验结果显示pLLO-hEGF对这些肿瘤细胞不产生促增殖作用。其免疫激活作用研究结果显示：pLLO-hEGF可使体外培养的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中 CD3+CD4+ T细胞明显增殖。单次实验结果显示pLLO-hEGF刺激14天时PBMCs中CD3+CD4+ T细胞百分比可增至54.5%,而对照组为44.8%。且刺激增殖活化的T淋巴细胞在体内外实验中均显示出显著的杀伤肿瘤细胞作用。体外对上述几种表达EGFR肿瘤细胞的杀伤率分别为：HCT116, (69.89 ±1.05)%; HT-29, (60.40±2.33)%; A549, (49.45±1.72)%; NCI-H157, (85.26±4.82)%；SK-BR-3,(47.90±1.39)%。体内移植瘤模型实验结果显示,将刺激增殖的T淋巴细胞注射裸小鼠体内,显著抑制了肿瘤的生长,平均瘤重(0.178/0.224 g)明显小于对照组(0.550 g)(*P<0.05)。综上所述,我们的研究提供了一种研发新型抗肿瘤药物的新思路和新策略。此部分内容申请了国家发明专利(申请号：201410152549.2),目前在实审阶段,且相关内容已发表于Hum Vaccin Immunother (Human vaccines) (IF=3.643)和CellPhysiol Biochem杂志(IF=3.55)。第二部分：可激活免疫细胞靶向CD20阳性人淋巴瘤细胞重组蛋白的设计、表达及抗淋巴瘤作用的初步研究B细胞淋巴瘤是一种血液系统疾病,采用传统治疗手段临床疗效较差。随着对CD20分子结构特点的认识,抗CD20单克隆抗体的设计开发在B细胞淋巴瘤的临床治疗中取得重要进展。其中最具代表性的是1997年美国FDA批准上市的人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体一Rituximab (C2B8,美罗华)。但人鼠嵌合抗体由于其分子量大,穿透力弱,且毒副作用大,明显限制了其临床效果。近年来,一些人源化抗体、小型或改型抗体、基因修饰抗体逐渐发展起来。其中单链抗体(single chain variable fragments, ScFv)由于其分子量小、穿透力强、能够较好地保持抗原亲和性等特点,成为应用生物工程方法进行肿瘤免疫治疗的一种重要手段。本研究同样利用LLO的显性抗原肽设计、构建了靶向CD20阳性B细胞淋巴瘤的双功能重组蛋白ScFv-pLLO。首先,我们设计了针对人CD20的ScFv序列,然后将LLO显性抗原肽与ScFv序列拼接,使构建的重组蛋白既可靶向结合CD20阳性B细胞淋巴瘤细胞,同时其LLO抗原表位又可增强肿瘤细胞的抗原性,从而充分激活机体的细胞免疫应答,发挥更长效的抗肿瘤免疫,达到靶向免疫治疗的效果。双功能重组蛋白ScFv-pLLO经原核克隆、表达和纯化,并初步分析了其抗B细胞淋巴瘤作用。生物信息学软件分析显示重组蛋白理论分子量为32 kDa,化学性质稳定。流式细胞术定量分析几种人淋巴瘤细胞系细胞表面CD20表达情况,结果显示Daudi细胞CD20阳性率在98%以上,Raji和NCI-BL2009细胞CD20阳性率分别为89.7%和92.2%,而RAMOS细胞CD20阳性率是52.3%。流式细胞术分析ScFv-pLLO靶向结合人淋巴瘤细胞的能力,结果显示ScFv-pLLO可不同程度的靶向结合CD20表达水平不同的人淋巴瘤细胞,其浓度为10μg/mL时,对Daudi和NCI-BL2009细胞的平均结合率分别为(93.25±3.45)%和(73.85±3.95)%。免疫共沉淀实验结果进一步证明ScFv-pLLO可特异靶向结合人淋巴瘤细胞表面的CD20分子。细胞增殖实验结果显示ScFv-pLLO可抑制Raji细胞的生长,而对Daudi、RAMOS和NCI-BL2009淋巴瘤细胞的生长无影响。凋亡实验结果显示ScFv-pLLO可直接诱导Raji细胞凋亡,20μg/mL的ScFv-pLLO作用24 h后,可诱导24.6%的Raji细胞凋亡(早期+晚期),作用48 h后,Raji细胞总凋亡率可达47.0%。本研究的初步结果显示,双功能重组蛋白ScFv-pLLO可特异靶向结合CD20阳性B细胞淋巴瘤,对某些人淋巴瘤细胞系,如Raji细胞,可直接诱导其凋亡,结构和功能上类似“小型抗体”。同时,双功能重组蛋白ScFv-pLLO由于携带显性抗原肽,不同于纯粹的单克隆抗体,其靶向结合淋巴瘤细胞表面CD20分子后可增强肿瘤细胞激活免疫系统的能力,从而为我们下一步研究其对免疫细胞的激活作用以及激发长效抗肿瘤细胞免疫的功能奠定了基础。此部分内容已发表于《中国免疫学杂志》。第三部分：Leptin在结直肠癌细胞侵袭转移中的作用研究随着肿瘤分子生物学研究的深入,在肿瘤靶向治疗中,不断有新的候选抗肿瘤靶点出现。近几年,越来越多的研究发现Leptin介导的信号在肿瘤细胞的增殖、侵袭和肿瘤干细胞的诱导生成中发挥了重要作用,并被认为是潜在的有效抗肿瘤靶向治疗靶点。Leptin的中文名称为瘦素,是一种由167个氨基酸组成的非糖基化蛋白质类激素,主要由脂肪细胞分泌,参与机体的能量代谢。研究表明肿瘤组织也可表达Leptin及其受体(LEPR/Ob-R),其中较多数据显示结直肠癌的恶性程度与Leptin的表达量密切相关。一些实验结果显示高浓度的外源性Leptin可以促进人结直肠癌细胞的增殖,并增强其运动和侵袭能力。但目前较少关于肿瘤细胞产生的内源性Leptin在肿瘤细胞生长和侵袭力方面确切生物学作用的研究,而明确Leptin介导的信号通路对肿瘤细胞生物学行为的影响,有助于开发新型抗肿瘤靶向治疗药物。在研究中,我们首先分析了几种人结直肠癌细胞系中Leptin及其受体LEPR的表达情况,包括mRNA和蛋白水平。结果显示人结直肠癌细胞系均普遍表达Leptin和LEPR,包括细胞系HCT116、HT-29、COLO201、COLO205和SW480。以人结直肠癌细胞系HCT116和HT-29细胞为例,我们用siRNA有效敲低了肿瘤细胞中内源性Leptin的表达。细胞增殖实验结果显示,抑制内源性Leptin的表达对人结直肠癌细胞系HCT116和HT-29细胞的增殖无影响。然后我们通过Real-time PCR检测了一些与肿瘤细胞侵袭转移能力密切相关基因的表达情况,包括MMP1、MMP9、 TIMP-1、E-cadherin、Twist等。结果显示,抑制内源性Leptin表达,HCT116细胞中MMP1和MMP9的表达明显上调(*P<0.05),TIMP-1、TIMP-2 和 E-cadherin的表达明显下调(*P<0.05)；HT-29细胞中,MMP1和Vimentin的表达明显上调(*P<0.05),TIMP-2的表达明显下调(*P<0.05)。以HCT116为例,Western blot进一步检测蛋白表达水平变化,其结果与mRNA水平变化一致。此外,明胶酶谱实验结果显示,抑制内源性Leptin表达,HCT116细胞中MMP9的蛋白裂解活性增强。Transwell体外侵袭实验结果显示,与对照组穿膜细胞数(148±17)相比,HCT116细胞Leptin RNAi组穿出小室微孔膜的细胞数明显增多(512±23)(*P<0.05),表明HCT116细胞的侵袭能力明显增强。本研究不同于以往的研究,重点分析了抑制人结直肠癌细胞内源性Leptin的表达,对肿瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。研究发现,降低Leptin的表达对细胞增殖无影响,但却明显增强了细胞的侵袭能力。而以往的研究结果是提高Leptin的浓度会促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。因此,进一步探明不同条件下Leptin信号通路在结直肠癌细胞中的具体生物学作用机制,可为确定此通路能否用于肿瘤靶向治疗靶点选择奠定基础。