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【研究目的】多胺是存在于所有生物中脂肪族多聚离子,主要包括腐胺(Put),精脒(Spd)和精胺(Spm)。是调节细胞生长的重要物质,它可以通过改变DNA结构和调节信号传导途径等方式调节基因的表达,从而在细胞生长和分化过程中发挥着重要的作用。细胞周期的维持也需要多胺的合成。鸟氨酸脱梭酶(O D C)和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)是多胺生物合成的的关键酶。多数学者认为多胺的过度生成与肿瘤的发生有关。如果能有效减弱多胺在肿瘤细胞中的过度表达,则可抑制肿瘤细胞的生长。因而研究抑制多胺合成的关键酶的方法就成了进来癌症治疗的热点。我们在成功构建并扩增出ODC和AdoMetDC双反义RNA腺病毒载体的基础之上,研究鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒对食管癌细胞凋亡的影响,为进一步研究食管癌基因治疗的方法提供理论依据和技术对策。【研究方法】①构建鸟氨酸脱羧酶(ODC)和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)双反义RNA腺病毒载体。②重组腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染效率的测定。采用FACS检测Ad-GFP感染细胞中GFP表达,以测定不同感染复数(MOI)的腺病毒对食管癌Eca109细胞的基因转染效率。酶标仪(BIO-RAD Model 680)测定570nm处的吸光值。③应用MTT法实验观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响。测定被不同感染复数重组腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染细胞的增殖程度,并绘制不同感染细胞的生长曲线。④采用Western印迹检测Eca109细胞转染腺病毒(Ad-ODC-AdoMetDCas)后,其ODC和AdoMetDC蛋白表达的量。将食管癌Eca109细胞分别感染50 MOI的Ad-GFP,Ad-ODCas和Ad-ODC-AdoMetDCas 72 h后收集细胞。用裂解液抽提细胞总蛋白。蛋白样品浓度采用BCA法测定。⑤采用HPLC法检测食管癌Eca109细胞胞转染腺病毒(Ad-ODC-AdoMetDCas)后,其多胺的含量。收集10~7个细胞,用PBS冲洗两遍后离心。将高氯酸加入到细胞沉淀中离心,取上清液。用HPLC系统测定多胺的含量。⑥应用TUNEL标记检测法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡的影响。腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas,Ad-ODCas和Ad-GFP分别以50MOI感染ECA109细胞后,用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。⑦应用透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。【研究结果】①基因转染效率实验结果显示,以50MOI的Ad-GFP感染食管癌Eca109细胞48h后,大约有75%食管癌Eca109细胞GFP表达阳性,但不会引起细胞毒性(图1)。②重组腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞有剂量依赖性的抑制作用(图2),根据实验结果挑选食管癌Eca109细胞的感染滴度为50MOI。正常情况下食管癌Eca109细胞生长迅速,而感染Ad-ODC-AdoMetDCas后细胞生长明显减慢,细胞生长曲线更趋低平(图3),最大生长抑制率可达70%,而无明显细胞毒性。③采用Western印迹法显示以Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达,ODC和AdoMetDC含量明显减少。④HPLC结果显示,食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内三种多胺含量都明显降低(p＜0.05)。⑤TUNEL标记检测结果证实,Ad-ODC-AdoMetDCas可引起食管癌Eca109细胞明显凋亡。⑥透射电镜下可见,典型的细胞凋亡特征,表现为细胞体积缩小,核皱缩、碎裂,染色质呈块状边集等。【研究结论】ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)能显著抑制食管癌细胞生长增殖,降低细胞多胺合成,促进细胞凋亡,为探讨食管癌基因治疗的可行性提供实验依据。