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大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。但目前对大肠癌的早期诊断及治疗效果依然不甚理想。临床上,急需更为有效的方法提高大肠癌的诊断效率及治疗效果,使大肠癌患者从中获益。激活素A具有多种生物学活性,包括参与多种肿瘤的发生、发展;尽管已有部分研究表明激活素A在大肠癌组织表达,但关于大肠癌患者血清激活素A水平、激活素A对大肠癌细胞作用的信号转导机制等仍未明确。因此,本研究检测了健康对照者、大肠良性息肉及大肠癌患者血清激活素A水平,结果发现大肠癌患者血清激活素A水平较健康对照者及大肠良性息肉患者血清激活素A水平明显升高,并且激活素A水平与大肠癌分期存在一定关联。RT-PCR、Western blotting及免疫组织化学染色等结果确认了激活素A是由大肠癌细胞分泌,提示激活素A可能成为辅助诊断大肠癌的新的肿瘤标记物。本研究又通过吉姆萨染色及流式细胞术等方法检测激活素A对大肠癌细胞系SW480细胞的作用,发现激活素A可以诱导SW480细胞凋亡。另外,本研究还通过基因敲低及过表达等方法证明激活素A通过Smads信号传导途径诱导SW480细胞凋亡。一、大肠癌患者血清及组织中激活素A水平变化1.健康对照者、大肠良性息肉患者及大肠癌患者血清激活素A水平应用ELISA试剂盒检测健康对照者、大肠良性息肉患者及大肠癌患者血清激活素A水平,结果发现:大肠癌患者血清激活素A水平较健康对照者及大肠良性息肉患者血清激活素A水平明显升高;大肠癌术后患者血清激活素A水平较术前明显下降,提示大肠癌患者血清激活素A来源于大肠癌组织。2.激活素A在大肠癌组织中的表达应用RT-PCR及Western blotting检测激活素A m RNA及蛋白在大肠癌组织中的表达。结果显示,大肠癌组织可高表达激活素A。免疫组织化学染色进一步表明大肠癌细胞高表达激活素A。3.血清激活素A水平与大肠癌分期的关系大肠癌患者血清激活素A水平与其分期相关,即I期大肠癌患者血清激活素A水平明显低于II期、III期大肠癌患者,提示血清激活素A水平与大肠癌的术前分期有关。4.血清激活素A与癌胚抗原的比较与常用的大肠癌肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)相比,激活素A具有更高的特异性,故在临床上,联合应用CEA及血清激活素A可能提高大肠癌诊断的准确性。通过以上结果确认了激活素A在大肠癌患者血清及组织中的表达,并提示激活素A可能成为辅助诊断大肠癌的肿瘤标记物。二、激活素A诱导大肠癌细胞系SW480发生凋亡的作用1.激活素A在大肠癌细胞系SW480中的表达应用RT-PCR及Western blotting检测大肠癌细胞系SW480细胞激活素A表达,结果发现SW480细胞可表达激活素A。与前述实验结果相符。2.激活素A诱导SW480细胞凋亡实验采用MTT法测定细胞活力,结果提示:在外源性激活素A作用下,大肠癌细胞系SW480细胞活力减弱。应用吉姆萨染色检测激活素A对SW480细胞的作用。结果发现:SW480细胞发生核固缩、凋亡小体等。提示激活素A可诱导SW480大肠癌细胞发生凋亡。进一步应用流式细胞术检测激活素A对SW480的凋亡作用。结果显示:激活素A可诱导SW480大肠癌细胞发生凋亡,且呈时间及浓度依赖性。3.激活素受体及Smad3在SW480细胞中的表达Smads途径为经典的激活素A信号转导通路,本实应用RT-PCR及Western blotting检测了激活素A受体及Smad3在SW480细胞中的表达。结果发现:激活素A处理的SW480细胞Smads通路的关键蛋白Smad3及Act RIIA与Act RIIB均升高,且呈浓度依赖性。提示激活素A可能通过Smads信号传导途径诱导SW480大肠癌细胞凋亡。三、Smad3基因敲低减弱激活素A诱导的SW480细胞凋亡作用SW480细胞转染Smad3 sh RNA表达质粒敲低Smad3基因表达,再应用流式细胞术检测激活素A诱导SW480大肠癌细胞的凋亡作用。结果显示,Smad3基因敲低后激活素A诱导SW480细胞凋亡明显减少。该结果进一步表明Smad3信号介导了激活素A诱导SW480大肠癌细胞凋亡作用。四、Smad3基因过表达对激活素A诱导SW480细胞凋亡作用的增强SW480细胞转染Smad3表达质粒,再应用流式细胞术检测激活素A诱导SW480大肠癌细胞的凋亡作用。结果显示,Smad3基因过表达后激活素A诱导SW480细胞凋亡明显增加。该结果进一步确定Smad3信号介导了激活素A诱导SW480大肠癌细胞凋亡作用。结论:1.研究发现大肠癌患者血清激活素A水平升高,表明其可以作为大肠癌肿瘤标记物用于临床辅助诊断。2.研究表明激活素A用于大肠癌辅助诊断其特异性明显高于CEA,更具有早期临床样本筛查价值。3.研究证实激活素A可诱导大肠癌SW480细胞凋亡,其作用与Smads信号传导途径有关,提示激活素A也具有治疗大肠癌的潜能。