3-羟基丙酸(3-HP)作为重要的平台化合物,有着广阔的市场前景。Klebsiella pneumoniae因其较高的甘油耐受性、较强的甘油代谢能力、发酵周期短等特点成为利用甘油生物法生产3-HP的优势宿主菌。但由于可用启动子相对较少,且少数已知可用的启动子转录活性相对较弱,造成3-HP的生产过程转化率较低。本研究针对这一问题进行探索,通过构建K. pneumoniae高效表达系统,对K. pneumoniae甘油代谢途径进行改造,实现3-HP的高产。1、选择K. pneumoniae中13个生长代谢必需基因的启动子构建组成型启动子库,利用GFP报告系统对启动子进行筛选,获得了具有较高转录活性的组成型启动子Pkan,该表达系统无需加入诱导剂即可实现相对恒定的高效表达,其转录活性约为K. pneumoniae常用表达系统pET-pk的1.7倍,且对菌体的生长代谢影响较小,可用于构建K. pneumoniae高效组成型表达系统。2、为提高3-HP产量,利用Pkan过表达来自Escherichia coli醛脱氢酶基因aldH,构建的重组菌可实现甘油到.3-HP的高效转化。重组菌的摇瓶发酵数据表明,3-HP产量为0.47g/L,与野生菌相比提高了89.5%,与具有相同代谢负荷的空质粒对照菌相比增加了238%。上罐发酵实验,目的产物的产量为15.28g/L,甘油转化率达13.02%,时空产率为0.57 g·L-·h-1。3、为提高启动子的转录活性,对tac启动子核心序列进行串联获得复合启动子。利用此表达系统过表达醛脱氢酶基因puuC,构建的重组菌可实现3-HP的高产。重组菌摇瓶发酵结果表明重组菌K.p(pETP3core-tac-puuC)、K. p(pETP5core-tac-puuC)的3-HP产量分别为2.88g/L、3.10g/L。上罐发酵结果表明,3-HP的终产量分别为99.8 g/L81.4g/L；甘油转化率分别是87.7%,69.3%；时空产率分别为1.04g·L-1·h-1,1.36g·L-1·h-1。重组菌K.p(pETP3core-tac-puuC)的3-HP产量为目前报道最高,且在发酵结束时,乳酸的产量接近0g/L,这对于3-HP的实际生产具有十分重要的意义。