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摘要:目的:探讨金莲花粗提物对H1N1流感病毒感染小鼠模型体内TLR3信号通路关键因子的影响方法:扩增H1N1流感病毒并用红细胞凝集实验和TCID50测定其滴度,将80只ICR小鼠按照随机分组法分为正常组、灌药正常组、模型1、2、3组、灌药模型1、2、3组,每组10只。用50ul生理盐水给正常组和灌药正常组小鼠滴鼻,其余各组小鼠均用50 ul H1N1流感病毒滴鼻感染,各组滴鼻的病毒滴度分别是模型1组和灌药模型1组101LD50,模型2组和灌药模型2组100LD50,模型3组和灌药模型3组10-1LD50。各组小鼠于病毒感染1小时后进行灌胃:用金莲花粗提物水溶剂(0.2mg/g体重/日)给灌药正常组和灌药模型1组、灌药模型2组、灌药模型3组的小鼠灌胃,用生理盐水给正常组和模型1组、模型2组、模型3组的小鼠灌胃(0.2mg/g体重/日);连续灌胃7d,每日早晨10:00称重并计算体重增长百分比;在病毒接种后第3、7天取尾静脉血进行白细胞计数;并进行取材和称重,计算肺脏指数,检测小鼠肺泡灌洗液,HE染色法观察小鼠肺组织感染状况;利用免疫组化实验和免疫印迹实验检测金莲花粗提物对H1N1流感病毒感染小鼠肺组织内TLR3信号通路关键因子TLR3、IRF3、IFN-β、TAK1、TBK1、IKKα和TLR7蛋白质表达水平的影响;通过免疫荧光实验对IRF3和IFN-β的表达进行细胞内定位分析。结果:获得滴度为1 07.5TCID50/0.1ml,红细胞凝集效价为1:128的病毒原液;体重增长百分比结果显示,与正常组相比,H1N1流感病毒感染导致灌药正常组、模型1～3组和灌药模型1～3组小鼠体重增长百分比低于正常组(P<0.05);与模型组相比,灌药模型组小鼠的体重增长百分比高于相应的模型组;尾静脉血白细胞计数结果显示,模型1～3组和灌药模型1～3组在第3、7日的白细胞计数平均值均大于正常组,而灌药正常组的计数平均值第3日低于正常组(P<0.05);灌药模型1～3在第3、7日的白细胞计数明显高于相应的模型1～3组(P<0.05);肺脏指数结果显示,模型1～3组和灌药模型1～3组的肺脏指数明显高于正常组和灌药正常组,且模型1～3组的肺脏指数明显高于灌药模型1～3组(P<0.05);脾脏指数结果显示灌药正常组、灌药模型1组、模型3组和灌药模型3组脾脏指数平均值明显高于正常组,灌药模型1组和3组脾脏指数平均值明显高于相应模型1组和3组(P<0.05);肺泡灌洗液结果显示:灌药正常组、模型1～3组与灌药模型1～3组细胞计数结果平均值均明显大于正常组,灌药模型1～3组的细胞计数结果平均值低于相应的模型1～3组(P<0.05);HE染色结果显示正常组小鼠肺组织肺泡结构完整,细胞核细胞质对比鲜明,肺泡呈现网状结构,且肺中的血管结构完整,灌药正常组小鼠的肺泡组织结构完整,与正常组小鼠肺组织相比无肉眼可见差别,而接种病毒的模型1～3组和灌药模型1～3组小鼠肺组织,与正常组小鼠肺组织相比,肺泡结构不清晰且无法看到明显的肺泡边缘,肺泡中都有明显的炎细胞浸润和不同程度的充血;确定相同剂量的金莲花粗提物的治疗对感染剂量不同的病毒感染小鼠具有保护作用。免疫组化结果显示,H1N1病毒感染均可增加TLR3、IRF3和IFN-β的表达,金莲花粗提物可以增加高剂量病毒感染的小鼠组织中的IFN-β的表达,降低中、低剂量病毒感染的小鼠组织中的IFN-β的表达;免疫印迹实验结果显示,H1N1病毒感染均可增加小鼠组织中的TLR3、TBK1、IRF3、IFN-β、TAK1、IKKα和TLR7蛋白的表达,其中高剂量病毒感染引发的免疫反应最强烈;金莲花粗提物能降低高剂量病毒感染引起的TLR3、TBK1、IRF3、TAK1、IKKα、TLR7蛋白表达量增加,而提高IFN-β表达量。免疫荧光实验结果显示金莲花粗提物可以促进Ⅱ型肺泡细胞中IRF3抗体磷酸化入核,并能降低IFN-β在肺泡中的表达结论:金莲花粗提物能够有效改善H1N1流感病毒感染小鼠的健康状况,且可有效改善病毒小鼠肺部损伤情况,有效改善小鼠的肺功能,并可通过影响TLR3、IRF3、IFN-β、TAK1和TBK1等蛋白的表达,调节TLR3-TBK1-IRF3信号通路影响固有免疫系统,执行抗病毒功能;并确定金莲花粗提物不通过TLR7信号通路和IKKα相关的信号途径影响固有免疫系统,为金莲花粗提物的临床应用提供实验依据,并为发现金莲花粗提物的作用靶点提供实验证据。