研究背景：下腰痛是一个重要的公共卫生问题,它是导致45岁以下人群劳动能力受限的最主要原因。流行病学调查显示,全世界约70%的成年人口在一生中至少经历过一次下腰痛。在美国下腰痛每年造成的经济损失约900亿美元,中国卫生统计年鉴显示2008年我国下腰痛位于所有慢性病患病率的第六位,可见在我国下腰痛造成的社会生产力损失同样十分巨大。虽然目前下腰痛的确切病因尚未完全阐明,但椎间盘退变无疑是一个重要的诱因。椎间盘内的髓核细胞通过分泌细胞外基质维持椎间盘功能,其数量减少和随之带来的细胞外基质代谢失衡是椎间盘退变重要的病理生理变化。近年来,细胞移植治疗椎间盘退变方兴未艾,间充质干细胞具有向髓核样表型分化的能力,在椎间盘退变的生物学修复领域具有广阔的应用前景。然而,由于椎间盘为乏血供组织,其能量代谢主要依靠糖酵解,导致其内部产生酸性、高渗、低氧和炎症因子蓄积的恶劣微环境,在椎间盘退变过程中上述微环境进一步恶化,使得间充质干细胞的代谢活力和生物学修复能力受到损害,而上述微环境因素中又以酸性微环境对间充质干细胞损害作用最为明显。有研究表明,人类椎间盘内的pH值随椎间盘退变程度的加重而下降。人类脂肪间充质干细胞具有获取方便、供体部位损伤小、来源丰富和增殖能力强等优势,是一种理想的椎间盘组织工程种子细胞。人类脂肪间充质干细胞的供体年龄可能是细胞活力的一个重要影响因素,退变椎间盘不同程度的酸性微环境对人类脂肪间充质干细胞生物学活力的损害程度也很可能存在差异。然而,不同年龄来源的人类脂肪间充质干细胞对退变椎间盘不同程度酸性微环境的耐受情况目前尚不清楚,阐明退变椎间盘不同程度酸性微环境对不同年龄组供体来源的人类脂肪间充质干细胞存活、增殖和细胞外基质代谢等生物学行为的影响,将为椎间盘生物学修复研究的种子细胞选择提供重要参考。本课题组前期研究发现,脂肪间充质干细胞对退变椎间盘存在一定的修复作用,但仅仅通过细胞移植、生长因子及抗炎药物注射等手段很难确保脂肪间充质干细胞植入后在退变椎间盘恶劣的微环境中长期保持生物学活力并发挥修复作用。近年来有学者在椎间盘内发现了间充质干细胞存在的证据,进一步的研究证实在人类退变髓核和终板中存在间充质干细胞,在人类纤维环中存在具有多向分化潜能的祖细胞；同时,动物的体内研究也证实髓核中存在间充质干细胞,并且发现这些内源性间充质干细胞在椎间盘内存在一定的迁移和修复行为,提示这种新型组织特异性间充质干细胞具有潜在的研究和应用价值。目前,髓核间充质干细胞的存在已经被多项研究所证实。本课题组在前期工作中成功分离培养出大鼠髓核间充质干细胞,它具有间充质干细胞的一般特性,能够实现成软骨、成脂和成骨分化,完全符合国际细胞治疗协会关于间充质干细胞的认定标准。然而,作为一种新型组织特异性间充质干细胞,髓核间充质干细胞是否能够成为一种更加合适的椎间盘组织工程种子细胞这个问题尚不得而知。比较退变椎间盘酸性微环境对髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的存活、增殖和细胞外基质代谢等重要生物学行为的影响,将有助于我们更好的理解这两种间充质干细胞的生物学特性,并对其在椎间盘生物学修复领域的应用前景做出正确的评价,从而为下一步开发具有潜在应用价值的椎间盘干细胞修复技术提供实验依据。基于上述研究进展与前期工作,本课题主要从以下两方面开展研究：(1)退变椎间盘酸性微环境对不同年龄组供体来源的人类脂肪间充质干细胞的活力、增殖以及细胞外基质代谢等生物学行为的影响；(2)退变椎间盘酸性微环境对大鼠髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的活力、增殖以及细胞外基质代谢等生物学行为的影响。第一部分：退变椎间盘酸性微环境对人类脂肪间充质干细胞生物学行为的影响目的：研究退变椎间盘酸性微环境对不同年龄组供体来源的人类脂肪间充质干细胞的存活、增殖以及细胞外基质代谢等生物学行为的影响,探索适合进行脂肪间充质干细胞移植干预的椎间盘微环境pH闽值,明确供体年龄对人类脂肪间充质干细胞酸性微环境适应能力的影响。方法：人类脂肪间充质干细胞根据供体来源分为未成年组(8-12岁,n=6)和成年组(33-42岁,n=6)。设立pH值7.4的培养条件作为标准培养条件,使用pH值为7.1,6.8和6.5的培养条件分别模拟正常椎间盘、轻度退变椎间盘和严重退变椎间盘的酸性微环境特征。采用异硫氰酸荧光素桥连膜联蛋白-V/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-V/propidium iodide staining, FITC-AV/PI)测定细胞存活。采用MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法测定细胞增殖。使用实时定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、 I型胶原(Collagen-I)、 II型胶原(Collagen-II)、基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制3(Tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3), p53和细胞凋亡蛋白酶3(Caspase-3)的mRNA表达水平,使用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、MMP-2和TIMP-3的蛋白表达水平。结果：退变椎间盘酸性微环境能够降低未成年组和成年组供体来源的人类脂肪间充质干细胞的存活和增殖能力,并且抑制它们的聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因和蛋白表达水平。未成年组和成年组供体来源的人类脂肪间充质干细胞对退变椎间盘酸性微环境的应答模式相似,但是未成年组供体来源的人类脂肪间充质干细胞对退变椎间盘酸性微环境的耐受能力强于成年组供体来源的人类脂肪间充质干细胞。结论：本研究显示退变椎间盘酸性微环境是人类脂肪间充质干细胞用于椎间盘生物学修复的重要有害因素,来源于未成年组供体的人类脂肪间充质干细胞可能更加适合用于椎间盘生物学修复,人类脂肪间充质干细胞用于椎间盘生物学修复可能在退变早期(当退变椎间盘病理组织微环境pH值大于6.8时)更加有效。第二部分：退变椎间盘酸性微环境对大鼠髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞生物学行为的影响目的：研究退变椎间盘酸性微环境对大鼠髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的存活、增殖以及细胞外基质代谢等生物学行为的影响。方法：我们将从健康雄性大鼠身上提取的髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞分别在四种不同的pH条件下进行培养,分别是标准条件(pH7.4)和模拟正常、轻度退变和重度退变的椎间盘微环境(pH值分别为7.1,6.8和6.5)；采用异硫氰酸荧光素桥连膜联蛋白-V/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-V/propidium iodide staining, FITC-AV/PI)评价细胞存活,CCK-8(Cell counting kit-8)测定细胞增殖,实时定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、I型胶原(Collagen-I)、 II型胶原(Collagen-II)、基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2). IV型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs4, ADAMTS4)和金属蛋白酶组织抑制剂3(Tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3)的基因和蛋白表达水平。结果：退变椎间盘酸性微环境能够显著抑制大鼠髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的存活与增殖；同时,该酸性微环境能够抑制上述两种间充质干细胞中聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原以及TIMP-3的基因和蛋白表达水平,并且提高MMP-2和ADAMTS4的基因和蛋白表达水平。但是,与脂肪间充质干细胞相比,该酸性微环境对髓核间充质干细胞的存活与增殖能力的抑制作用明显较弱,同时髓核间充质干细胞具有更高的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和TIMP-3表达水平,以及更低的MMP-2和ADAMTS4表达水平。结论：退变椎间盘的酸性微环境是髓核间充质干细胞和脂肪间充质干细胞修复椎间盘的主要障碍之一；髓核间充质干细胞较脂肪间充质干细胞更能耐受该酸性微环境,因而可能成为一种新型种子细胞用于椎间盘生物学修复。