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桑树隶属于蔷薇目(Rosales),桑科(Moraceae),为多年生木本植物,是一种重要的生态经济型林木。长期以来,对桑树的研究主要集中在种质资源、病虫害防控、育种与繁殖栽培等方面。关于桑树细胞学的研究有很多报道,但是其内容多偏重于染色体数目方面,对染色体核型分析研究尚少。研究桑属植物的染色体不仅可以为阐明桑树的分类、起源、进化及系统发育、遗传等提供细胞学依据,还可以对育种材料的倍性、育性、亲缘关系进行鉴定。由于桑属植物染色体形态较小且数目较多,采用传统的压片法制备染色体标本效果很不理想,所以限制了桑树细胞学方面的研究,并且其分子细胞学方面的研究更是空白。 荧光原位杂交技术依据碱基互补配对原理,将特殊修饰的核苷酸分子定位在染色体上,并且可以为染色体提供可识别的标记。与传统方法相比具有更简单、更直观、更快速且准确的特点。该技术可以对重复序列在染色体上进行定位,并研究其在植物基因组上的分布。虽然该技术在许多植物上得到广泛应用,但是迄今为止在桑属植物中还未见报道。基于此,本研究在优化桑属植物染色体制片方法的基础上,对桑属植物染色体荧光原位杂交过程中各个因素进行筛选和评价,建立了桑属植物的荧光原位杂交技术体系,初步分析了rDNA和端粒序列在桑属植物染色体上的分布特点,并对川桑(Morus notabilis)和滇桑(Morusyunnanensis)的染色体进行了核型分析。所获得研究结果如下: 1、桑属植物染色体数目及倍性分析 采用去壁低渗火焰干燥法进行桑树染色体制片:在生长最旺盛的上午8:00~9:00取桑树嫩叶作为材料;预处理采用8-羟基喹啉试剂于室温下避光处理3h;解离采用2.5%纤维素酶∶发现2.5%的果胶酶=1∶1(V/V)的混合酶液于室温下酶解2~3 h(不同桑树品种稍有差异)制片效果最佳。成功获得川桑、滇桑、湖桑32号、红果桑及云系列桑等23份桑属植物清晰的中期染色体制片。对这些桑树资源染色体数目进行鉴定发现,大多数桑树种质资源的体细胞具有28条染色体,还存在具有14、35、49、308条染色体的桑树种质资源,并且发现云19号可能是含有染色体数目为35条和49条细胞的混倍体。 2、建立桑属植物染色体荧光原位杂交体系 染色体制片预处理:染色体玻片于37℃烘箱内干燥2h,100μg/mL RNaseA溶液37℃温育1h,1μg/ml蛋白酶K溶液37℃温育15 min;杂交探针的最佳用量为6 ng/μl;最佳变性条件为:先将70%(V/V)的去离子甲酰胺溶液加在染色体玻片标本上,使染色体在72℃下变性10 min;将含探针的杂交液在95℃下处理6 min进行探针变性;最后在80℃共变性10 min后37℃杂交10h左右。通过荧光显微镜观察,发现不同桑树体细胞染色体上的5S rDNA和25S rDNA的位点数目及信号强度不同,推测桑属植物的rDNA的位点数目与其染色体的倍性无相关性,并且5S rDNA的位点的倍化变化幅度较25S rDNA大。 3、川桑端粒序列在染色体上的定位分析 通过采用拟南芥类型端粒序列探针对川桑中期染色体进行荧光原位杂交实验,结果发现,川桑的大部分染色体末端为拟南芥类型端粒序列,个别染色体末端没有端粒信号,极少数染色体上有内部端粒序列,并且每条染色体上端粒序列的长度是不同的。 研究结果为桑树的细胞遗传学研究以及核型分析提供基础资料,为桑树染色体进化、种间亲缘关系、系统进化关系等问题提供新的依据,从而指导杂交育种实践,为丰富桑属种质资源,选育优良品种提供基础。