论文部分内容阅读
目的：内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂非对称二甲基精氨酸（ADMA）是心血管疾病发生的重要危险因素，在冠心病病人血浆中浓度显著升高。我们假设一种新的eNOS增强剂AVE3085可以改善由ADMA导致的内乳动脉（IMA）内皮功能损伤，并通过相关实验验证。先天性心脏病（CHD）是新生儿出生缺陷中最常见的一种。血浆蛋白质中可能存在大量疾病生物标志物。此外，全基因组连锁分析发现同源结构域亮氨酸拉链编码基因（HOMEZ）与南亚人群CHD易感性相关。我们通过实验鉴定CHD血浆相关生物标志物并在中国CHD患者HOMEZ基因中筛选潜在的致病突变。方法：（1）对来自17例行冠状动脉搭桥（CABG）术病人的43个IMA血管环建立收缩-积累性舒张曲线，-8logM U46619诱导血管收缩，-11至-5logM乙酰胆碱（ACh）建立血管积累性舒张，在收缩前分别用ADMA（100μM）或ADMA（100μM）+AVE3085（30μM）孵育血管环。Western Blot检测eNOS的表达量。光泽精-增强化学发光法检测超氧阴离子（O2.-）的产生量。（2）应用双向电泳（2-DE）和质谱分析的方法，分析法洛氏四联症（TOF）患者，室间隔缺损（VSD）患者和健康者相比血浆蛋白质的变化。候选蛋白与疾病的相关性应用ELISA法进行进一步确认。此外，对400例单纯性VSD患者和400例健康者进行HOMEZ基因编码外显子突变分析。HOMEZ基因编码外显子及部分侧翼序列经PCR扩增，ABI3730自动序列分析仪测定序列。CLC workbench软件比较HOMEZ蛋白相应位点氨基酸多物种保守性。ExPASy-ProtScale在线工具分析氨基酸序列疏水性特征。Polyphen在线工具评估蛋白质结构和功能损伤。结果：（1）与对照组最大舒张相比（35.3±5.0%），ADMA孵育后-5logM ACh诱导的IMA最大舒张显著降低（12.7%±2.3%，P <0.05），AVE3085则可以一定程度恢复IMA的最大舒张（23.4±2.8%，P <0.05）。对照组中IMA的eNOS相对表达量为0.36±0.03，AVE3085（0.29±0.008，P=0.012）可以显著提高由ADMA导致的eNOS表达下调（0.05±0.04，P=0.014）。与对照组相比（0.51±0.102RLU/s/mg），ADMA还可诱导产生过量O2.（-2.97±0.25RLU/s/mg），而AVE3805可以明显抑制O-2.的产生（0.62±0.104RLU/s/mg，P <0.05）。（2）在TOF患者和VSD患者血浆中共找到18个差异表达的蛋白质点对应8种蛋白质。两种低表达的蛋白（Gelsolin，Ficolin-3）被选为候选蛋白采用ELISA法定量。TOF患者血浆Gelsolin浓度（76.30±4.42μg/ml，P=0.025，n=40）与对照组（131.80±23.46μg/ml）相比显著降低。TOF患者（4.930±0.355μg/ml，P=0.001，n=40）和VSD患者（5.548±0.343μg/ml，P=0.003，n=40）血浆Ficolin-3浓度与对照组（10.576±1.576μg/ml）相比也显著降低。在突变分析中， HOMEZ基因2号外显子的两个错义突变被检出（c.116C>T; c.630T>A）。这两个突变分别导致HOMEZ蛋白氨基酸第39位由丙氨酸（Ala）变为缬氨酸（Val），第210位有丝氨酸（Ser）变为精氨酸（Arg），且这两个位点在多物种保守性分析中高度保守。变异后的氨基酸疏水性与野生型相比也发生明显变化。蛋白质结构和功能受到较大影响。结论：（1）实验证明AVE3085可以通过增强eNOS的表达和抑制O-2.的产生逆转由ADMA导致的IMA内皮功能损伤。这一发现为冠状动脉搭桥术中的内皮保护开拓了思路，可用于提高搭桥血管的远期通畅率。（2）我们首次描述了CHD患者血浆蛋白质的变化，其中部分蛋白质的变化可用于解释CHD患者凝血时间延长，易发生肺部感染等病理改变的机制。此外，我们在单纯性VSD患者HOMEZ基因编码外显子中检测到了两个错义突变，这说明HOMEZ基因很可能是中国单纯性VSD患者的一个致病基因。这些蛋白质和基因均为CHD的重要生物标志物。